結(jié)直腸癌的基因檢測

1、結(jié)直腸癌的基因檢測,,2000年4月16日，梅艷芳姐姐梅愛芳因子宮頸癌病逝，終年41歲。2003年12月30日，梅艷芳因子宮頸癌病逝，終年40歲。2015年3月11日，梅艷芳二哥梅德明因喉癌病逝，終年62歲。,基因檢測,朱莉（2013）曾檢查出BRCA1基因缺陷，意味著她擁有87%和50%的幾率罹患乳癌和卵巢癌，再加上擁有癌癥家族史，她的母親就曾被查出患有乳癌，并最終死于卵巢癌。朱莉當(dāng)年實(shí)施雙側(cè)乳腺切除手術(shù)，引發(fā)全球關(guān)注。2015年

2、朱莉又以公開信的形式正式宣告，為了避免患癌，繼兩年前切除乳腺之后，她又接受了卵巢和輸卵管手術(shù),基因檢測的概念,基因：遺傳信息基因檢測是通過組織、體液或細(xì)胞對個(gè)體遺傳信息進(jìn)行檢測的技術(shù)，其檢測的信息可以是由DNA、RNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)承載。通過不斷進(jìn)步的生物信息學(xué)技術(shù)手段鏈接遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)，不斷加深人們對于生命的物質(zhì)本質(zhì)的認(rèn)識。,基因檢測在結(jié)直腸癌診斷治療中的作用（1）為篩查提供依據(jù)（2）盡早診斷（3）為治療方案

3、提供優(yōu)化（4）指導(dǎo)用藥,結(jié)直腸癌與基因檢測,結(jié)直腸癌與基因檢測,基因檢測在結(jié)直腸癌診斷治療中的作用（1）評估遺傳風(fēng)險(xiǎn)（2）評估化藥的療效及副作用（3）指導(dǎo)靶向藥物使用（4）指導(dǎo)免疫治療,結(jié)直腸癌基因檢測與遺傳風(fēng)險(xiǎn)評估,發(fā)病前十位惡性腫瘤數(shù)據(jù),結(jié)直腸癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)評估,風(fēng)險(xiǎn)評估/遺傳咨詢國家癌癥中心調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，2015年全國預(yù)計(jì)新增大腸癌376300例，死亡191000例，均位居第五（ Cancer statistics in

4、China,2015, CA-Cancer J Clin.2017 ）。大部分大腸癌呈散發(fā)，但家族性腫瘤綜合征在腸癌中也很常見。估計(jì)約有10-30%的患者具有家族聚集現(xiàn)象，其中5-6%與研究較為明確的多種遺傳綜合征明確相關(guān)? ---詳細(xì)的家族史? ---詳細(xì)的醫(yī)學(xué)和手術(shù)治療史

5、 ? ---相關(guān)的表現(xiàn)進(jìn)行直接檢查? ---風(fēng)險(xiǎn)咨詢 ? ---教育支持 ? ---遺傳檢測討論

6、 ? ---知情同意,遺傳學(xué)特點(diǎn),連續(xù)（或間斷）幾代中發(fā)生大腸癌（垂直遺傳）男女遺傳度相等，即一級親屬攜帶幾率為50%患者及親屬相關(guān)器官的腫瘤易感性提高發(fā)病年齡早多處原發(fā)癌,為什么要關(guān)注遺傳性大腸癌,一、重視度低、知名度低二、遺傳性結(jié)直腸癌并不罕見 - 10%-25%結(jié)直腸癌患者有家族史 - 近10%患者有明確致病基因三、臨床表現(xiàn)復(fù)雜：表現(xiàn)為綜合征 - 相同表

7、型不同基因型 - 相同基因型不同表型,NCCN指南建議：1、大約20%的結(jié)直腸癌伴有家族聚集性，新診斷的腺瘤或浸潤性癌患者，其一級親屬患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)增加。2、對于遺傳性結(jié)直腸癌，要求患者通常在進(jìn)行基因測序前進(jìn)行2輪的篩選：首先基于家族史，其次是對腫瘤組織進(jìn)行初始檢測。3、為了甄別那些可能屬于遺傳性結(jié)直腸癌的患者，可以對結(jié)直腸癌標(biāo)本進(jìn)行2項(xiàng)初始檢測：免疫組織化學(xué)檢測錯配修復(fù)蛋白表達(dá)(MMR)；分析微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)。

8、,為什么要關(guān)注遺傳性大腸癌,Lynch 綜合征,Lynch綜合征（林奇綜合征），又稱遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（HNPCC），占結(jié)直腸癌患者2-4%，一種呈常染色體顯性遺傳的家族性腫瘤綜合征，主要由錯配修復(fù)基因（mismatch repair gene，MMR）缺失引起(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM），hMLH1和hMSH2突變約占檢出的種系突變的90％，hMSH6突變約占7％-10％，hPMS2

9、突變占不到5％?；颊進(jìn)MR基因缺失，主要是由基因突變或啟動子甲基化引起，其中MLH1和MSH2基因突變占所有基因改變的90以上。MMR基因突變或啟動子甲基化可導(dǎo)致MMR基因功能缺失，從而引起含有錯配堿基、核苷酸插入或缺失的DNA分子不能正常修復(fù)，最終引起廣泛的MSI。,MMR蛋白IHC結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn),Lynch 綜合征,dMMR：MMR基因缺失；pMMR：MMR基因正常；,MSI-H：高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定；MSI-L：低度微衛(wèi)星不穩(wěn)

10、定；MSS： 微衛(wèi)星穩(wěn)定。,微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）是指DNA甲基化或者基因突變致錯配修復(fù)基因缺失，從而導(dǎo)致微衛(wèi)星重復(fù)序列插入或缺失，繼而長度改變，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。約15%的結(jié)直腸癌中存在MSI，主要是微衛(wèi)星序列堿基對的替換和移碼突變。散發(fā)性腸癌中最常見的就是hMLH1基因啟動子區(qū)高甲基化，導(dǎo)致MSI的發(fā)生。,Lynch 綜合征,MSI檢測,腫瘤中的MSI-H（又稱dMMR）是指在預(yù)先確定的微衛(wèi)星重復(fù)標(biāo)記組中具有一定比例改變的

11、腫瘤，喪失MMR活性。其檢測意義、運(yùn)用和提示作用均與IHC 相似，盡管兩者略有互補(bǔ)性。MSI的檢查主要采用美國國立癌癥研究所推薦的的5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記(D2S123、 D5S346、 D17S250 、BAT25和 BAT26)。PCR主要是檢測DNA分子鏈上的MSI狀態(tài)，國內(nèi)通常對以下位點(diǎn)（NR-27、NR-24、NR-21、BAT-25、BAT-26、MONO-27 、PentaC、PentaD、PentaE等）進(jìn)行檢測。MSI 檢測

12、的假陰性率約5%-10%。,MSI檢測,MSI檢測,N/A:未行檢測或檢測結(jié)果不影響檢測策略 + 正常蛋白染色 --蛋白染色缺失,腫瘤IHC染色及相關(guān)基因檢測策略,遺傳性大腸癌基因檢測病例,說明： 已知致病突變，表示該突變在現(xiàn)有的研究報(bào)道中與疾病有關(guān)，致病機(jī)理明確，遺傳統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著，有相關(guān)功能驗(yàn)證。疑似致病突變，是指功能預(yù)測可能是致病的，但還未有確鑿的臨床證據(jù)。臨床意義未明表示該變異有研究報(bào)道，但與關(guān)系不明的變異。

13、疑似良性多態(tài)性是指該變異有研究報(bào)道是良性的，但還未有確鑿的臨床證明。良性多態(tài)性是指該變異在臨床研究表明不能導(dǎo)致疾病，與疾病沒有關(guān)系,結(jié)直腸癌化療與基因檢測,大腸癌綜合治療的幾種模式,傳統(tǒng)模式： 手術(shù)治療手術(shù)治療－術(shù)后輔助化療（結(jié)腸癌）手術(shù)－術(shù)后放化療（直腸癌）術(shù)前新輔助放化療－手術(shù)－術(shù)后輔助化療（直腸癌）術(shù)前新輔助化療－手術(shù)治療－術(shù)后輔助化療（腸癌肝轉(zhuǎn)移）手術(shù)＋術(shù)后輔助化療 ＋靶向治療/免疫治療（晚期腸癌）,CSCO20

14、19大腸癌術(shù)后輔助化療推薦,除臨床試驗(yàn)外，不推薦在輔助化療中使用如下藥物：伊立替康、替吉奧、TAS-102、所有的靶向藥物（包括貝伐珠單抗、西妥昔單抗、帕尼單抗、阿柏西普、瑞戈非尼、呋喹替尼等） 和所有的免疫檢查點(diǎn)抑制劑（pembrolizumab 和 nivolumab 等）,CSCO2019關(guān)于潛在可切除mCRC轉(zhuǎn)化治療推薦,CSCO2019關(guān)于mCRC姑息治療推薦,CSCO2019關(guān)于mCRC姑息治療推薦,CSCO2019關(guān)于mC

15、RC姑息治療推薦,CSCO2019關(guān)于mCRC姑息治療推薦,大腸癌常見化療方案,CapeOX奧沙利鉑 130 mg/m2 IV，第一天* 卡培他濱 1000 mg/m2，每天兩次口服，第1~14天，隨后休息7天 每3周重復(fù),mFOLFOX6 奧沙利鉑 85 mg/m2靜脈輸注，第1天* LV 400 mg/m2靜脈輸注，第1天** 5-FU 400 mg/m2靜脈推注，第1天

16、，然后1200 mg/m2/d×2天持續(xù)靜脈輸注，（總量2400 mg/m2，輸注46~48小時(shí)）每2周重復(fù),mFOLFOX7奧沙利鉑130 mg/m2靜脈輸注，第1天* LV 400 mg/m2靜脈輸注，第1天** 5-FU 1200 mg/m2/d×2天持續(xù)靜脈輸注（總量2400 mg/m2，輸注46~48小時(shí)）每2周重復(fù),（NCCN2018指南）,大腸癌常見化療

17、方案,FOLFIRI 伊立替康180 mg/m2靜脈輸注大于30-90分鐘，第1天 LV 400 mg/m2靜脈輸注2小時(shí)，配合伊立替康注射時(shí)間，第1天 5-FU 400 mg/m2靜脈推注，第1天，然后1200 mg/m2/d×2天持續(xù)靜脈輸注 （總量2400 mg/m2，輸注46~48小時(shí)）每2周重復(fù),FOLFOXIRI伊立替康 165mg/m2靜脈輸注，第一天

18、，奧沙利鉑 85mg/m2靜脈輸注，第一天，LV 400mg/m2 第一天，5-FU 1600mg/m2/d x2天（總量3200 mg/m2 大于48小時(shí)）從第一天起持續(xù)輸注 每兩周重復(fù) 此處所列5-FU劑量來自于歐洲的研究。有證據(jù)表明北美的患者對5-FU的耐受性較差。強(qiáng)烈推薦北美患者采用與FOLFOX或FOLFIRI方案相同的5-FU劑量。,（NCC

19、N2018指南）,大腸癌常見化療方案,鉑類奧沙立鉑毒理：通過產(chǎn)生水化衍生物作用于DNA，形成鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)，從而抑制DNA 的合成，產(chǎn)生細(xì)胞毒作用和抗腫瘤活性。鉑類藥物耐藥機(jī)制主要包括：DNA 修復(fù)能力增強(qiáng)藥物，解毒增加，減少藥物攝取積聚,大腸癌化療與基因檢測,鉑類研究表明ERCC1，XRCC1，和GSTP1基因多態(tài)性及mRNA表達(dá)與毒副作用與用藥效果密切相關(guān)ERCC1：DNA 切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1，其是核苷酸切除修復(fù)(NE

20、R)通路中的關(guān)鍵性酶,正常表達(dá)是維持修復(fù)酶功能的分子基，反應(yīng)患者對鉑類藥物敏感性。XRCC1：參與因電離輻射和氧化損傷引起的BER(堿基切除修復(fù)途徑)和單鍵斷裂修復(fù),對維持基因的穩(wěn)定性起著關(guān)鍵作用,同時(shí)與鉑類藥物抵抗有關(guān)。GSTP1：谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶P1是細(xì)胞抗損傷,抗癌變的主要解毒系統(tǒng)，GSTP1 基因多態(tài)性的存在可引起其表達(dá)的相應(yīng)酶的活性不同,導(dǎo)致解毒功能發(fā)生改變,與鉑類化療的療效密切相關(guān)（亦與很多其他化療藥藥效相關(guān)）,大腸癌化療

21、與基因檢測,大腸癌化療與基因檢測,氟尿嘧啶類藥物5-Fu、卡培他濱、S-1毒理：5-Fu或5-Fu前體進(jìn)入體內(nèi)后經(jīng)代謝，產(chǎn)生5-Fu，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為有效的氟尿嘧啶脫氧核苷酸后，通過阻斷脫氧核糖尿苷酸受細(xì)胞內(nèi)胸苷酸合成酶轉(zhuǎn)化為胸苷酸，而干擾 DNA、RNA的合成。,大腸癌化療與基因檢測,氟尿嘧啶類研究表明DPYD，MTHFR、TYMS基因多態(tài)性與mRNA表達(dá)毒副作用與用藥效果密切相關(guān)DPYD：二氫嘧啶脫氫酶基因，編碼二氫嘧啶脫氫酶

22、（DPD），其為5-Fu代謝關(guān)鍵酶MTHFR：亞甲基四氫葉酸還原酶，MTHFR還原5,10-亞甲基四氫葉酸為5-甲基四氫葉酸，前者為胸苷酸重要原料，后者為體內(nèi)主要甲基供體。TYMS：胸苷酸合酶（TS）是嘧啶核苷酸合成的限速酶，它是5-FU發(fā)揮細(xì)胞毒作用的目標(biāo)酶。,大腸癌化療與基因檢測,大腸癌化療與基因檢測,DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑（喜樹生物堿）伊立替康毒理：半合成的喜樹堿類可溶性衍生物，在肝臟內(nèi)能迅速水解為有活性的代謝物SN-38

23、，后者為拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，可抑制DNA單鏈斷裂后修復(fù)，干擾DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。代謝：SN-38的代謝主要是經(jīng)尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶家族，特別是肝臟內(nèi)的UGT1A1滅活為葡萄糖醛酸產(chǎn)物(SN-38G)，然后經(jīng)膽汁排泄入腸道，在腸道細(xì)菌β-葡萄糖醛酸酶作用下轉(zhuǎn)換為 SN-38，引發(fā)腸黏膜損傷；而腸道內(nèi)的UGT1A1又可再度催化SN-38為SN-38G，解除腸粘膜損害,DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑（喜樹生物堿）研

24、究表明UGT1A1基因突變與毒副作用與用藥效果密切相關(guān)UGT1A1 ：UGT1A1啟動子不典型TATA盒區(qū)域包含7個(gè)TA重復(fù)序列，該變異型與UGT1A1表達(dá)下降有關(guān)，并導(dǎo)致伊立替康活性代謝產(chǎn)物SN-38水平顯著增加，從而發(fā)生腹瀉/中性粒細(xì)胞減少的幾率顯著增加。UGT1A1*28 rs8175347）突變的雜合子個(gè)體發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)較純合子增加了約7倍，因此建議患者在使用伊立替康前先檢測UGT1A1基因型，對UGT1A1純合

25、子基因型患者應(yīng)慎重考慮給藥劑量,大腸癌化療與基因檢測,大腸癌化療與基因檢測,大腸癌化療與基因檢測,病例,結(jié)直腸癌靶向治療與基因檢測,截止2018年10月已經(jīng)獲得FDA批準(zhǔn)的結(jié)直腸癌靶向及免疫治療藥物列表：貝伐單抗（Avastin®），西妥昔單抗（Erbitux®），帕尼單抗（Vectibix®），ziv-aflibercept（阿柏西普，Zaltrap®），瑞戈非尼（ Stivarga&

26、#174; ），Ramucirumab（雷莫蘆單抗，Cyramza® ），Nivolumab（納武單抗，Opdivo® ），Ipilimumab （伊匹單抗，Yervoy） ® ），呋喹替尼（愛優(yōu)特）,結(jié)直腸癌靶向藥物,結(jié)直腸癌基因突變,,,,,,結(jié)直腸癌中常見基因突變,30-40%,3-5%,10-15%,15-18%,13-19%,exon 2：codon 12, 13exon

27、3/4：codon 61, 117, 146,exon 2：codon 12, 13 exon 3：codon 61,V600E,exons 9 and 20,loss of function,Hui-Yan Luo ，et al.World J Gastroenterol. Apr 14, 2014; 20(14): 3858–3874,EGFR突變檢測,表皮生長因子受體（Epidermal Growth Factor R

28、eceptor，EGFR）主要位于細(xì)胞膜上，屬受體酪氨酸激酶家族。 EGFR被配體激活后啟動胞內(nèi)該通路上的信號傳導(dǎo)，經(jīng)過細(xì)胞質(zhì)中銜接蛋白、酶的級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子激活基因的轉(zhuǎn)錄，指導(dǎo)細(xì)胞遷移、黏附、增殖、分化和凋亡。 EGFR下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有兩條：一條是Ras/ Raf/ MEK/ ERK-MAPK 通路另一條是PI3K/Akt/mTOR通路。,確定為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌時(shí)，推薦檢測RAS、BRAF基因狀態(tài)所有轉(zhuǎn)移性

29、結(jié)直腸癌患者都應(yīng)檢測KRAS基因狀態(tài)；只有KRAS野生型患者才建議接受EGFR抑制劑如西妥昔單抗（Cetuximab）和帕尼單抗（panitumumab）的治療一些KRAS/NRAS野生型的患者同樣無法受益于靶向藥物，野生型BRAF對愛必妥/帕尼單抗的有效性是必須的。結(jié)直腸癌大約有5-9%的患者發(fā)生BRAF突變。EGFR不推薦作為常規(guī)檢查項(xiàng)目,《NCCN結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南2015》《結(jié)直腸癌診療指南》（2015版）《結(jié)直腸

30、癌KRAS基因突變檢測專家共識》.中華病理學(xué)雜志,2012年;9:635-636.,臨床意義,原發(fā)瘤部位對EGFR單抗療效預(yù)測的最強(qiáng)有力證據(jù)來自CALGB/SWOG 80405研究。該研究結(jié)果顯示對于全RAS野生型mCRC患者。原發(fā)瘤位于右側(cè)（回盲部到肝曲）時(shí)，一線治療接受含貝伐單抗的治療患者相較西妥昔單抗治療者，具有更長的OS（HR 1.36;95%CI 0.93-1.99; p=0.10）；而當(dāng)原發(fā)瘤位于左側(cè)時(shí)（脾曲到直腸），接

31、受西妥昔單抗治療者較貝伐單抗治療者具有更長的OS（HR=0.77; 95%CI 0.59-0.99;p=0.04）。與貝伐單抗相比，左半患者接受西妥昔單抗治療后OS被延長了（39.3月對比32.6月），但在右半患者中卻縮短了（13.6月對比29.2月）,在49%～82%的結(jié)直腸癌中存在EGFR的過表達(dá)。結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞的EGFR檢測無論是對西妥昔單抗還是帕尼單抗均無療效預(yù)測價(jià)值。來自BOND-1試驗(yàn)的數(shù)據(jù)表明腫瘤細(xì)胞EGFR的免疫組化

32、染色強(qiáng)度與對西妥昔單抗的治療反應(yīng)率之間并沒有相關(guān)性。帕尼單抗的情況也相似。因此，并不推薦常規(guī)檢測EGFR，也不能依據(jù)EGFR檢測結(jié)果來推薦或排除西妥昔單抗或帕尼單抗的治療。,臨床意義,（NCCN2018指南）,有大量文獻(xiàn)表明KRAS基因第二外顯子突變預(yù)示著對西妥昔單抗及帕尼單抗的治療無效。近來更多的證據(jù)顯示KRAS第二外顯子以外的突變以及NRAS突變也可以預(yù)測對西妥昔單抗和帕尼單抗的治療無效。 因此，專家組強(qiáng)烈建議對

33、所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者進(jìn)行腫瘤組織（原發(fā)瘤或轉(zhuǎn)移灶均可）的KRAS/NRAS基因突變檢測。已知KRAS/NRAS突變的患者，均不應(yīng)接受西妥昔單抗或帕尼單抗的治療，不管單藥還是與化療聯(lián)合，因?yàn)檫@些患者不但沒有機(jī)會從治療中獲益，而且還將面臨治療的毒性和費(fèi)用，得不償失。,臨床意義,（NCCN2018指南）,哺乳動物基因組中普遍存在三種RAS癌基因家族成員：HRAS、KRAS、NRAS，這三種基因編碼的蛋白質(zhì)大約有90%的氨基酸同源序列，分子量

34、均為21kDa，故稱為RASp21蛋白，其在功能上與G蛋白相似，可與二磷酸尿苷(GDP)結(jié)合為非活性狀態(tài),KRAS基因是RAS基因家族中三種癌基因的一種，位于12號染色體上，含有4個(gè)編碼外顯子和1個(gè)5’端非編碼外顯子，共同編碼含189個(gè)氨基酸的RAS蛋白。KRAS是表皮生長因子受體功能信號的下游分子，屬膜結(jié)合型GTP／GDP結(jié)合蛋白，通過GTP和GDP的相互轉(zhuǎn)化作用有節(jié)制的調(diào)節(jié)KRAS基因?qū)π盘栂到y(tǒng)的開啟和關(guān)閉，傳遞細(xì)胞生長分化信號。,

35、RAS基因與其靶向藥物,KRAS基因突變發(fā)生在腫瘤惡變的早中期，并且原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的KRAS基因狀態(tài)基本保持一致。當(dāng)KRAS基因催化活性區(qū)突變時(shí)，該基因永久活化，不能產(chǎn)生正常的RAS蛋白，導(dǎo)致RAS蛋白不依賴EGFR受體激活而持續(xù)活化，造成RAS信號通路的異?；罨?，影響細(xì)胞的生長、增殖和分化，促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控而癌變。,KRAS基因最常見的突變方式為點(diǎn)突變，90％的KRAS基因突變位于2號外顯子的第12和13密碼子位點(diǎn)

36、，另有1～4％為第61和146密碼子突變。其中結(jié)直腸癌中第12密碼子（約82％）是最常見的突變位點(diǎn)。一般中國人群樣本檢測數(shù)據(jù)G12A高于G12S/C，西方人群相反。,RAS基因與其靶向藥物,西妥昔單抗和帕尼單抗均通過直接抑制EGFR從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。西妥昔單抗治療的有效性受其下游基因KRAS狀態(tài)的影響，突變型的KRAS無需接受上游EGFR信號即能夠自動活化該通路并啟動下游信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此只有KRAS基因野生型的患者才能從抗EGFR的

37、治療中獲益，而突變型的患者則不能。 KRAS野生型患者使用西妥昔單克隆抗體和帕尼單克隆抗體治療效果確切，可顯著提高患者的生存率和改善生活狀態(tài)，建議使用；而KRAS的2號外顯子的12號密碼子和（或）13號密碼子或其他密碼子任意突變型患者使用西妥昔單抗和帕尼單克隆抗體抗治療無效，建議不使用該類藥物。 臨床實(shí)踐表明，只有50%的野生型KRAS患者對抗EGFR治療有效，提示EGFR下游信號通路其他分子的激活和

38、變異可能影響了其治療反應(yīng)。因此，KRAS基因突變的檢測僅用于預(yù)測結(jié)直腸癌對抗EGFR靶向藥物的治療效果。,BRAF基因是1988年由Ikawa等首先在人類尤文肉瘤中發(fā)現(xiàn)并克隆確認(rèn)的一種能轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞且有活性的DNA序列。BRAF基因與ARAF、CRAF基因同屬RAF家族，命名為鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1，位于人染色體7q34，長約190kb，編碼783個(gè)氨基酸的蛋白，相對分子質(zhì)量為84436，有CR1、CR2和CR3三個(gè)保

39、守區(qū)。,BRAF是Ras-Raf-MEK-ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，具有功能的編碼區(qū)由2510對堿基組成，主要通過有絲蛋白激酶通路中的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶來發(fā)揮作用，該酶將細(xì)胞表面的受體和RAS蛋白通過MEK和ERK與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子相連接，啟動多種因子參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)事件，如細(xì)胞生長、分化和凋亡。,RAS基因與其下游基因,BRAF是位于KRAS下游級聯(lián)信號通路上的一個(gè)重要蛋白，當(dāng)BRAF基因發(fā)生突變后，其編碼生成的蛋白產(chǎn)

40、物無需接受上游信號蛋白的活化便始終處于激活狀態(tài)，啟動下游細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起細(xì)胞增殖，從而使EGFR抑制劑西妥昔單克隆抗體和帕尼單克隆抗體等療效減弱或無效。BRAF基因可作為患者預(yù)后評價(jià)的獨(dú)立性指標(biāo)，BRAF V600E突變患者呈現(xiàn)預(yù)后更差的趨勢。 對于KRAS基因野生型但同時(shí)具有BRAF基因V600E突變的患者，抗EGFR單克隆抗體靶向藥物治療可能無效?；仡櫺詠喗M分析顯示，無論BRAF基因V600E是否存在突變，一

41、線治療采用抗EGFR單克隆抗體聯(lián)合有效的化療藥物都有可能使患者獲益。目前有限的研究數(shù)據(jù)提示，一線治療后病情進(jìn)展的患者，如果存在BRAF V600E突變，使用抗EGFR單克隆抗體的療效欠佳。,RAS基因與其下游基因,PIK3CA基因與靶向藥物,PIK3CA是位于3號染色體上的原癌基因。PIK3CA基因編碼的蛋白是PI3Ks的催化亞單位，PI3Ks是一種脂激酶家族，能特異性磷酸化磷脂酰肌醇的3位羥基，產(chǎn)生第二信使肌醇類物質(zhì)。PI3Ks家族分

42、I型、II型和III型，其中I型又分為IA和IB兩個(gè)亞型，PIK3CA則是IA型的催化亞單位。PIK3CA基因的突變可以導(dǎo)致PI3Ks的催化活性異常增強(qiáng)，促使細(xì)胞發(fā)生癌變，與結(jié)直腸癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、乳腺癌和肺癌相關(guān)。其重要致瘤機(jī)制為PI3K/AKT通路是細(xì)胞信號傳導(dǎo)中一個(gè)重要通路，PI3Ks能特異性磷酸化磷脂酰肌醇的3位羥基，產(chǎn)生第二信使肌醇類物質(zhì)如PIP3，PIP3可促使AKT轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上并被PDK1/PDK2活化，AKT則是

43、PI3K/AKT信號通路中核心因子，異?；罨腁KT會導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。,PIK3CA突變約80%發(fā)生在螺旋區(qū)(Helical)和激酶區(qū)(Kinase)這兩個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域，其中最常見的三個(gè)突變是外顯子20上的H1047R，外顯子9上的E542K和E545K。 PIK3CA基因在結(jié)直腸癌中的陽性突變率相對較高，約15-20%，且往往與KRAS、NRAS、BRAF發(fā)生交叉突變。既往發(fā)表的薈萃分析研究結(jié)果顯示PIK3CA突變的患者相

44、對于野生型的患者化療客觀有效率(ORR)明顯降低，并且有較差PFS及OS的趨勢。PIK3CA突變的CRC患者使用阿司匹林者能夠顯著延長總生存時(shí)間，而PIK3CA野生型者，則無受益。 PIK3CA基因的激活突變可能導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者對EGFR抗體類藥物產(chǎn)生耐藥。單克隆抗體帕尼單抗和西妥昔單抗靶向表皮生長因子受體(EGFR)，且已被證明對mCRC有治療價(jià)值。 EGFR介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)涉及兩個(gè)主要的細(xì)胞內(nèi)級聯(lián)反

45、應(yīng)：一方面KRAS激活BRAF，其反過來觸發(fā)絲裂原活化的蛋白激酶。另一方面，脂質(zhì)激酶 PIK3CA的膜定位抵消PTEN并促進(jìn)AKT1磷酸化，從而激活平行的細(xì)胞內(nèi)軸。KRAS的構(gòu)成型激活繞過了相應(yīng)的信號級聯(lián)反應(yīng)，因此攜帶KRAS突變的mCRC患者在臨床上對帕尼單抗或西妥昔單抗治療具有抗性。研究學(xué)者進(jìn)行了PIK3CA和KRAS的突變分析并評估了110例用抗EGFR moAbs治療的mCRC患者中的PTEN蛋白狀態(tài)。觀察到有15例(13.6％

46、)患者攜帶PIK3CA突變，32例患者(29.0％)攜帶KRAS突變。PIK3CA 突變與帕尼單抗或西妥昔單抗的臨床耐藥顯著相關(guān)，且沒有一個(gè)突變患者達(dá)到客觀反應(yīng)(P=0.038)，當(dāng)僅分析KRAS野生型腫瘤時(shí)，統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性更強(qiáng)(P=0.016)。而PIK3CA突變患者的無進(jìn)展生存期也顯示出更差的臨床結(jié)果(P=0.035)[12 ]。,PIK3CA基因與靶向藥物,PTEN基因,PTEN基因，又稱為MMAC1和TEP1。定位于染色體10q2

47、3.3，由9個(gè)外顯子組成，編碼由403個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，具有蛋白磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶活性，是第一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因，也是繼p53和Rb基因之后，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的一種抑癌基因，其主要機(jī)制因?yàn)镻TEN是PI3K/Akt通路的主要負(fù)調(diào)控因子。PTEN蛋白可通過拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有證據(jù)顯示，PTEN蛋白還有協(xié)助控制細(xì)胞轉(zhuǎn)移、細(xì)胞與與周圍組織的粘附和血管發(fā)生等功能。此外，這種蛋白可能在維持細(xì)胞遺傳信

48、息的穩(wěn)定性上具有重要作用。PTEN減少與轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌患者，肺癌和可能成膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者的抗EGFR治療耐藥性有關(guān),KDR基因,全名：Kinase insert domain receptor，也叫VEGFR-2（vascular endothelial growth factor receptor 2 ，血管內(nèi)皮生長因子2）位于4號染色體功能：KDR則主要介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,導(dǎo)致血管通透性的增高,并阻止內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,維持內(nèi)皮細(xì)胞的存

49、活,與胚胎期內(nèi)皮細(xì)胞的分化有關(guān),KDR與癌癥的關(guān)系：腫瘤的生長和擴(kuò)散依賴于血管生成。腫瘤血管生成對于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后具有重要作用,腫瘤血管生成是一系列復(fù)雜的調(diào)控過程,其中VEGF及其受體發(fā)揮著重要作用,KDR的生物學(xué)效應(yīng)　VEGF主要有三種受體即: VEGFR-1 ( Flt-1) 、VEGFR-2 ( Flk-1 /KDR) 、VEGFR-3。Flt-1主要介導(dǎo)細(xì)胞骨架重排引起細(xì)胞遷移,并引起單核細(xì)胞趨化,與胚胎期內(nèi)皮細(xì)胞

50、形態(tài)形成有關(guān); Flk-1 /KDR則主要介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,導(dǎo)致血管通透性的增高,并阻止內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,維持內(nèi)皮細(xì)胞的存活,與胚胎期內(nèi)皮細(xì)胞的分化有關(guān); VEGFR-3的表達(dá)與內(nèi)皮細(xì)胞形成靜脈或淋巴管有關(guān)。大腸癌組織中KDR 的表達(dá)陽性率顯著高于正常大腸組織，F(xiàn)lk-1 /KDR在癌巢邊緣及壞死組織附近亦成彌漫性分布,纖維腺瘤中VEGF呈陰性或弱陽性表達(dá),微衛(wèi)星不穩(wěn)定性,微衛(wèi)星是短DNA序列的串聯(lián)重復(fù)序列，在基因組中廣泛存在。在腫瘤的

51、整個(gè)基因組中，會有些微衛(wèi)星有很多小的基因突變，導(dǎo)致有些微衛(wèi)星發(fā)生不穩(wěn)定，這種現(xiàn)象就是微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）。 FDA已經(jīng)批準(zhǔn)了2種免疫治療藥物的適應(yīng)證，正式將MSI作為一種有效的生物標(biāo)記物（Biomarker）列入到臨床實(shí)踐中：2017年FDA批準(zhǔn)了Pembrolizumab應(yīng)用在成人和兒童，MSI-H或dMMR的，沒有其他治療選擇的，不可切除或轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤患者

52、。2017年8月，F(xiàn)DA又批準(zhǔn)了nivolumab在MSI-H或dMMR結(jié)直腸癌中的相似適應(yīng)證。 MSI與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展及5-FU治療獲益密切相關(guān)，針對II期結(jié)腸癌患者進(jìn)行的大樣本隨機(jī)臨床研究發(fā)現(xiàn)，MSI-H患者較MSS或MSI-L患者的預(yù)后更好，但MSI-H患者不能從5-FU輔助治療中獲益，而MSS和MSI-L患者可從5-FU輔助治療中獲益。因此，MSI同樣可作為預(yù)測II期結(jié)腸癌患者預(yù)后以及是否可從5-FU輔

53、助治療中獲益的指標(biāo)。,- 63 -,MMR/MSI,MMR：錯配修復(fù)蛋白通路檢測方法IHC： MMR-deficient(dMMR) MMR-proficient(pMMR)PCR：MSI-H(微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定) MSI-L(微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定) MSS(微衛(wèi)星穩(wěn)定)MMR與MSI一致率>90% dMMR=MSI-H pMMR=MSI-L/

54、MSS,PD-1/PD-L1免疫療法是當(dāng)前備受矚目的新一類抗癌免疫療法，旨在利用人體自身的免疫系統(tǒng)抵御癌癥，通過阻斷PD-1/PD-L1信號通路使癌細(xì)胞死亡，具有治療多種類型腫瘤的潛力，有望實(shí)質(zhì)性改善患者總生存期（OS）。,NCT01876511 研究結(jié)果表明，PD-1 單抗治療對 MSI-H 的 mCRC 表現(xiàn)出高緩解率。如圖：黑線、紅線分別代表 MSI-H 和 MSS 的患者，無論是從無進(jìn)展生存期還是總體生存率來看，同樣是接受 K

55、eytruda 治療的情況下，具有 MSI-H 特征的比具有 MSS(微衛(wèi)星穩(wěn)定性) 特征的 mCRC 患者生存期更長。,基因檢測與腫瘤免疫治療,調(diào)動機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)，殺傷腫瘤細(xì)胞,免疫治療概念,1.傳統(tǒng)細(xì)胞因子類藥物 可及性強(qiáng) 抗腫瘤作用較弱 藥物使用強(qiáng)度不統(tǒng)一 2.特異性抗體類藥物 臨床驗(yàn)證階段

56、（大陸） （PD-1、PD-L1、CTLA-4 等） 價(jià)格高 3.過繼性免疫細(xì)胞類 限于批準(zhǔn)的臨床研究（大陸） （CAR-T、DC、CIK 等） 價(jià)格昂貴（境外）,目前免疫治療的可及性,免疫治療效果預(yù)測,一、遺傳學(xué)標(biāo)記,腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden, TMB；tumor mutation load, TML）新抗原（neoantigen）微衛(wèi)星不穩(wěn)定（m

57、icrosatellite instability, MSI）錯配修復(fù)（mismatch repair，MMR）,檢測,下一代基因測序（NGS）全基因組測序（WGS）全外顯子測序（WES）,分析,驅(qū)動基因（Driver gene）錯配修復(fù)基因（mismatch repair gene）突變組學(xué)（mutanome）突變負(fù)荷（TMB）新抗原（neoantigen）,評價(jià),dMMRpMMRMSI-HMSI-LTMB-H

58、TMB-L,根據(jù)相關(guān)的T細(xì)胞類型可將大腸癌分為三種類型,Lee S. Schwartzberg. Post-ASCO Immunotherapy Highlights,,免疫檢查點(diǎn)抑制劑（Immune checkpoint inhibitors）,展望,基因檢測將為未來的抗體偶聯(lián)藥物提供用藥指導(dǎo),ctDNA（液體活檢） ——新一代腫瘤標(biāo)志,ctDNA不僅可以診斷實(shí)體腫瘤，而且能夠監(jiān)測治療反應(yīng)以及探查微小殘留病灶

59、、靶向治療耐藥突變，可能是優(yōu)選的無創(chuàng)腫瘤篩查方法。 —— 美國斯坦福大學(xué)Maximilian Diehn教授 ctDNA是一種具備廣泛應(yīng)用前景、高敏感性、高特異性的腫瘤標(biāo)志物，適用多種不同的實(shí)體腫瘤。未來，廣泛的成像和侵入性的組織活檢

60、將會被替代，液體活檢可能被用于指導(dǎo)癌癥治療決策，以及用于可能尚未成像的腫瘤篩查。 —— 美國約翰霍普金斯大學(xué)Luis Diaz博士,ctDNA(Circulating Tumor DNA),cfDNA（cellfree DNA），或者叫血漿游離DNA，是血漿中游離存在的DNA

61、，它們有的來自于正常細(xì)胞，有的來自于異常細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞），還有部分來自于我們外部（如病 毒DNA）。人們發(fā)現(xiàn)cfDNA中 攜帶腫瘤特有突變的那一小部分DNA，確確實(shí)實(shí)是由腫瘤細(xì)胞釋放出來的。這種攜帶了突變信息的循環(huán)DNA是腫瘤的標(biāo)志，ctDNA的研究終于與腫瘤關(guān)聯(lián)起來。ctDNA來源：1、來自于壞死的腫瘤細(xì)胞；2、來自于凋亡的腫瘤細(xì)胞；3、來自于腫瘤細(xì)胞分泌的外排體。突變類型：點(diǎn)突變（SNV），短的插入缺失（InDel），拷

62、貝數(shù)變異（CNV），結(jié)構(gòu)變異（SV）等等。發(fā)現(xiàn)過程：70年代Leon等研究表明癌癥患者外周血清DNA水平大大高于正常人。1989年Stroun等發(fā)現(xiàn)血液游離DNA具有腫瘤細(xì)胞DNA的一些特征。5年后研究者在腫瘤患者的血漿和血清中檢測到癌基因的突變，與原發(fā)瘤一致。,不同腫瘤和分期均可釋放ctDNA,發(fā)現(xiàn)不同的癌癥有較大的差異卵巢癌，結(jié)直腸癌等幾乎能百分之百檢測到ctDNA腦腫瘤的檢出率不到10%——這或許和不同組織的特性，如血

63、腦屏障有關(guān),圖1：不同癌癥的ctDNA檢出情況,在幾乎所有種類的癌癥中，都檢測到了ctDNA所帶有的標(biāo)志性突變并且腫瘤越晚期，病情越嚴(yán)重，腫瘤的惡性程度越高， ctDNA特有突變的頻率就越高。一項(xiàng)針對15種癌癥進(jìn)行的ctDNA測序研究顯示，分別有47%，55%，69%，82%的I-IV期癌癥病人中能檢測到高于一定頻率的ctDNA突變；而另一項(xiàng)使用更高靈敏度測序技術(shù)的研究則表示，對于II期以上的病人，均能100%檢測到突變。,圖2：