骨髓源肝干細胞的克隆化及其生物學特性的研究.pdf

1、干細胞是指具有自我復制能力和分化潛能的細胞。通常將干細胞分為兩大類型：胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞是指來源于囊胚期內(nèi)細胞團的細胞，這些細胞具有多分化潛能，幾乎可以分化為機體任何類型的細胞。成體干細胞則是指分布于成體組織或器官內(nèi)的干細胞，這種干細胞也具有向一個或多個方向分化的潛能。 骨髓是成體干細胞最多的細胞庫。骨髓細胞其主要包括兩大類細胞。一類是造血細胞，包括少量的造血干細胞、造血祖細胞和不同發(fā)育階段的血細胞；另一類是骨髓

2、基質(zhì)細胞，包括網(wǎng)狀細胞、成纖維細胞、巨噬細胞、脂肪細胞和血竇內(nèi)皮細胞等。一般認為，骨髓基質(zhì)細胞不僅參與骨髓網(wǎng)狀組織的構成，對造血細胞起支持作用，而且通過細胞間的相互接觸和多種體液因子及粘附分子的作用，調(diào)節(jié)造血細胞的增殖、分化和成熟。但研究表明骨髓基質(zhì)細胞中還存在著具有多向分化的潛能的細胞群，被稱為骨髓間質(zhì)干細胞(BMSCs)。其在一定的條件下可向三個胚層的細胞分化，例如骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞，骨骼肌細胞、心肌細胞、內(nèi)皮細胞，神經(jīng)原

3、和肝細胞等。 大部分從大鼠股骨和脛骨中取得的BMSCs都是通過貼壁法而獲得，但是貼壁的細胞除了MSCs之外，還有貼壁的吞噬細胞、內(nèi)皮細胞、淋巴細胞和平滑肌細胞，使得培養(yǎng)的MSCs的在形態(tài)上具有多樣性。MSCs不但在大小，形態(tài)上，而且在分化潛能和擴展能力方面也很不一致。各種分離和純化，富集MSCs的方法已經(jīng)迅速發(fā)展，如免疫磁珠和流式技術，但至今，人們還仍然沒法確定用這些方法富集的細胞是不是一致性的。因為沒有一種或一組聯(lián)合抗體對MS

4、Cs是特異性的。即使現(xiàn)今報道的非常純化的群體由于在傳代中分化祖細胞，即過渡細胞的產(chǎn)生，使得這種純化的細胞群體也異質(zhì)化。而且，隨著傳代，某些MSCs會保留其多向分化潛能，但也有一些要么只能朝某個特定方向分化，要么開始衰老死亡。因此，成體干細胞在體外傳代和擴增的困難極大地限制了它們的應用。很明顯，在臨床廣泛應用之前，必須要建立一種在體外大量擴展MSCs，但又不能影響其分化潛能的方法。我們基于非平衡細胞動力學的抑制(SACK)理論，應用了一種

5、新的方法去建立成體干細胞株(系)并在體外培養(yǎng)擴增。非平衡細胞動力學對于成體干細胞保持其在體內(nèi)的功能是必需的，卻是體外擴增的阻力，因此，從非平衡細胞動力學向平衡細胞動力學的轉(zhuǎn)變將促使成體干細胞的指數(shù)增殖并保持其在體外長期傳代的穩(wěn)定性。黃苷(Xs)便充當了這種角色。 在前期工作中，我們以2-AAF/CCl4程序構建急性肝損傷動物模型，取損傷后的肝臟萃取物作為骨髓間質(zhì)干細胞的實驗組刺激物進行誘導培養(yǎng)，用RT-PCR技術檢測細胞分子表面

6、標志的變化。結果顯示：實驗組BMSCs誘導至11d表達幼稚肝細胞標志M2-PK、GST-P，而對照組誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞無此改變，這說明損傷的肝臟能夠產(chǎn)生某種因子，可以激活干細胞向肝細胞方向的分化。那么，本實驗所得到的單細胞克隆能否對這些因子產(chǎn)生應答反應了?通過這種誘導的方法，我們可以篩選出能夠向肝細胞方向分化的干細胞。 實驗方法：1、利用貼壁法分離培養(yǎng)原代雄性大鼠骨髓間質(zhì)干細胞，培液中含400μMXs和1ng/mlEGF，

7、 2、再高度稀釋這種混合細胞并以單細胞接種于96孔板。記錄并培養(yǎng)擴增單細胞的克隆。 3、采用3％2-AAF/CCl4急性肝損傷模型雌性SD大鼠的肝組織勻漿誘導這些單細胞克隆，取誘導第十一天和第二十天細胞，RT-PCR檢測BST-1、GST-P、M2-PK及AlbuminmRNA的表達；同時用正常同種雌性大鼠肝勻漿作對照培養(yǎng)。 4、對比培養(yǎng)細胞，優(yōu)化細胞培養(yǎng)方法。 結果：1、得到14株單細胞克隆，記為C1、C

8、2、C3……C14等； 2、所有單細胞克隆均表達髓系來源標志BST-1mRNA，誘導11d時，C7、C11、C14三株細胞表達BST-1mRNA和幼稚肝細胞標志GST-P及M2-PKmRNA，誘導20d細胞BST-1、GST-P和M2-PKmRNA的表達消失，但未見成熟肝細胞標志AlbuminmRNA的表達出現(xiàn)。其余細胞株在誘導11d時未見幼稚肝細胞標志GST-P及M2-PKmRNA的表達，誘導20d時，AlbuminmRNA也

9、未出現(xiàn)。 3、對比實驗發(fā)現(xiàn)改良培養(yǎng)方法優(yōu)于普通常規(guī)方法，單細胞克隆培養(yǎng)易于擴增。 結論：(1)本實驗應用貼壁分離法從大鼠股骨和脛骨中取得骨髓混合間質(zhì)干細胞，通過高度稀釋這種混合間質(zhì)干細胞并以單細胞接種于96孔板內(nèi)，應用“非平衡細胞動力學的抑制(SACK)”的新理論，嚴格按照制作單細胞克隆的要求，通過傳代和擴增，獲得了11株單細胞克隆。同樣的培養(yǎng)條件下，與非克隆化的骨髓混合間質(zhì)干細胞對比培養(yǎng)顯示，克隆化的細胞易于在體外長期

10、快速增殖。 (2)前期實驗已經(jīng)表明，損傷肝勻漿中存在著有誘導干細胞向肝細胞方向分化的化學信號，即某些微量因子。因此，本實驗采用損傷肝勻漿誘導這11株單細胞克隆。結果表明，C7、C11、C14三株細胞的形態(tài)逐漸向上皮細胞樣改變，并出現(xiàn)了幼稚肝細胞分子M2-PK和GST-P的表達，透射電子顯微鏡也顯示了誘導組的細胞具有了上皮樣細胞的超微結構特征，說明這三株細胞可以向肝細胞方向分化，我們稱之為骨髓源性肝干細胞。 (3)其他單細

11、胞克隆株沒有對損傷肝勻漿作應答反應，說明這些細胞不能向肝細胞方向分化，但究竟這些細胞是不是干細胞或是其他組織細胞的祖細胞則需進一步研究。 (4)通過體外傳代擴增發(fā)現(xiàn)，三株肝干細胞在改進的培養(yǎng)條件下，其倍增時間為2～3d，而在一般的普通培養(yǎng)條件下，其倍增時間為5～6d。所以，用優(yōu)化的培養(yǎng)條件培養(yǎng)細胞，可以快速增殖肝干細胞并使其不老化，在此基礎上，如果由細胞二維培養(yǎng)改為三維培養(yǎng)，則有望在短期內(nèi)為肝病治療提供大量的肝干細胞。