骨髓間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變致瘤及其腫瘤干細(xì)胞分離與生物學(xué)特性研究.pdf

1、目的：研究大鼠間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)致瘤模型及致瘤后獲得單克隆腫瘤細(xì)胞株(K3)的生物學(xué)特性；建立K3腫瘤干細(xì)胞(K3-SP)分離、鑒定的方法；初步采用細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)等探討K3腫瘤干細(xì)胞與非腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性及基因表達(dá)；探討無(wú)血清培養(yǎng)對(duì)K3腫瘤干細(xì)胞的富集作用。
　　 方法：采用生長(zhǎng)曲線(xiàn)、流式表面標(biāo)記、PCR、免疫組化等技術(shù)來(lái)研究K3細(xì)胞的生物學(xué)特性。制備K3細(xì)胞懸液，經(jīng)過(guò)Hoechst33342熒光染料染色，流式細(xì)胞儀

2、分析并分選出SP亞群。采用五種培養(yǎng)方法培養(yǎng)K3：5％FBS、10％FBS、無(wú)血清、無(wú)血清加三種生長(zhǎng)因子培養(yǎng)K3及K3細(xì)胞BALB/c裸鼠皮下致瘤。獲得足夠量的K3細(xì)胞后，取瘤組織過(guò)400目銅網(wǎng)得到單細(xì)胞懸液。單細(xì)胞懸液經(jīng)過(guò)Hoechst33342熒光染料染色，使用流式細(xì)胞儀分選出K3-SP細(xì)胞和K3-NSP-細(xì)胞。分選得到的K3-SP細(xì)胞和K3-NSP細(xì)胞進(jìn)行BALB/c裸鼠皮下致瘤實(shí)驗(yàn)并觀(guān)察比較瘤體積的大小。使用晶芯(R)大鼠全基因組

3、寡核苷酸微陣列芯片比較K3-SP/K3-NSP細(xì)胞基因表達(dá)差異，使用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因。比較K3-SP致瘤組織和K3-SP致瘤組織ABCG2、OCT4、PCNA、P53的免疫組化結(jié)果。利用無(wú)血清培養(yǎng)以富集K3-SP細(xì)胞。
　　 結(jié)果：K3腫瘤細(xì)胞表達(dá)大鼠間質(zhì)干細(xì)胞相似的表面抗原如CD29,CD44,CD90,弱表達(dá)CD45；K3腫瘤細(xì)胞具有一般腫瘤細(xì)胞表達(dá)基因與生長(zhǎng)特性，能夠在BALB/c裸鼠致瘤；K3腫瘤

4、細(xì)胞具有異質(zhì)性，同時(shí)含有少量的腫瘤干細(xì)胞。不同胎牛血清濃度培養(yǎng)下，K3細(xì)胞中K3-SP細(xì)胞含量有差異，5％FBS培養(yǎng)與10％FBS培養(yǎng)分析得K3-SP含量分別為1.01％和0.73％。K3-SP較K3-NSP BLAB/c裸鼠致瘤率明顯增強(qiáng)，5×103K3-SP細(xì)胞即可裸鼠致瘤，其組織類(lèi)型為纖維肉瘤?；蛐酒治鲲@示，K3-SP與K3-NSP差異表達(dá)基因56個(gè)，其中上調(diào)40個(gè)，下調(diào)16個(gè)，Real-timePCR驗(yàn)證了T-Bx3、Maf

5、b、Plk2等上調(diào)基因和Vegf一個(gè)下調(diào)基因。免疫組化顯示K3-SP致瘤組織為P53、Pcna、Abcg2、Oct4陽(yáng)性，而K3-NSP致瘤組織為陰性。K3細(xì)胞在含有bFGF、EGF、LIF三種因子的無(wú)血清培養(yǎng)基與不含三種因子的培養(yǎng)基中均呈懸浮球狀生長(zhǎng)，Real-time PCR顯示Oct4在兩種無(wú)血清培養(yǎng)基中表達(dá)均有差異。無(wú)血清加三種因子培養(yǎng)基中培養(yǎng)15天后，SP含量達(dá)到7.73％，具有明顯的富集K3-SP的作用。
　　 結(jié)論