具有益生菌特征的陰道乳酸桿菌的篩選及其生物學(xué)特性的研究.pdf

1、婦女陰道是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，乳酸桿菌是其中占主導(dǎo)地位的細(xì)菌，對(duì)維持陰道微生態(tài)環(huán)境的平衡起到了關(guān)鍵作用。乳酸桿菌發(fā)揮作用的機(jī)制推測(cè)為：1) 粘附上皮細(xì)胞，阻止病原菌初始粘附；2) 分泌有機(jī)酸，起到陰道自凈作用；3) 產(chǎn)生細(xì)菌素；4) 產(chǎn)生H<,2>O<,2>；5) 產(chǎn)生生物表面活性蛋白物質(zhì)；6) 刺激宿主局部免疫。研究表明乳酸桿菌制劑不僅可以阻止病原菌對(duì)陰道的感染，而且對(duì)治療陰道感染有顯著的效果。目前國內(nèi)外都有相關(guān)的商品化乳酸桿菌制劑

2、，在預(yù)防治療陰道感染中起到了重要的作用。 本文采用改良MRS培養(yǎng)基對(duì)162份健康孕婦陰道樣本中的嗜酸性細(xì)菌進(jìn)行了定向篩選。通過革蘭氏染色、細(xì)胞形態(tài)觀察以及生理生化實(shí)驗(yàn)初步將分離的細(xì)菌確定為乳酸桿菌，共獲得326株乳酸桿菌。通過TMB-HRP-MRS培養(yǎng)基對(duì)其產(chǎn)H<,2>O<,2>能力進(jìn)行了半定量分析。獲得H<,2>O<,2>陽性菌株244株。其中H<,2>O<,2>弱陽性菌株為89株，陽性116株，強(qiáng)陽性39株。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明

3、：產(chǎn)H202菌株在孕婦中的檢出率為87.59％，其分布與孕周以及孕婦年齡相關(guān)；產(chǎn)H<,2>O<,2>乳酸桿菌的檢出率隨著孕周的增加而升高，隨著孕婦年齡的增長而降低。 乳酸桿菌屬涵蓋了102種，德氏乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、唾液乳桿菌等菌種在食品藥品領(lǐng)域顯示出良好的應(yīng)用前景。傳統(tǒng)的乳酸桿菌鑒定方法主要是依據(jù)形態(tài)學(xué)觀察和簡單生理生化反應(yīng)。本研究除了運(yùn)用API細(xì)菌學(xué)鑒定金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行生理生化鑒定之外，還運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)的技術(shù)對(duì)乳酸

4、桿菌的鑒定進(jìn)行了探討，嘗試采用兩次PCR，即組間和組內(nèi)PCR的方法將分離菌株鑒定到種。結(jié)果表明，在孕婦陰道中檢出率較高的是嗜酸乳桿菌和卷曲乳桿菌，H<,2>O<,2>產(chǎn)量較高的也是嗜酸乳桿菌和卷曲乳桿菌。 篩選具有較強(qiáng)拮抗病原菌能力的陰道乳酸桿菌，可以作為益生菌制劑用于治療陰道細(xì)菌感染。本研究采用Hela細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂疾炝巳樗釛U菌分離株的黏附能力，采用雙層平板法考察各分離株對(duì)致病菌的拮抗能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌的黏附能力具有菌

5、種的差異，同一種不同株的差異也很大。乳酸桿菌分離株中有53.24％的菌株對(duì)白色假絲酵母有抑制作用，13.65％的菌株有較強(qiáng)的拮抗作用。黏附拮抗實(shí)驗(yàn)表明乳酸桿菌可以阻止白色假絲酵母對(duì)于Hela細(xì)胞的黏以拮抗白色假絲酵母能力為主要指標(biāo)，綜合對(duì)其它三種致病菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌)的拮抗作用以及對(duì)Hela細(xì)胞的黏附能力，從326株陰道乳酸桿菌分離株中篩選得到11株有益生效果的乳酸桿菌，對(duì)其分類學(xué)地位、益生的生物學(xué)特性進(jìn)行了較

6、全面的分析。首先測(cè)定了11株陰道乳酸桿菌的16S rRNA基因(即16S rDNA)全序列，在基因數(shù)據(jù)庫(GenBank、EMBL、DDBJ、PDB)中進(jìn)行了同源性搜索。取相似度大于99％的序列為參考，對(duì)其進(jìn)行了鑒定，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，確定了其在系統(tǒng)發(fā)育中的分支地位。通過拮抗致病菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，11株乳酸桿菌對(duì)致病菌有較強(qiáng)的拮抗作用，提示可以用于治療致病菌感染，恢復(fù)乳酸桿菌的主導(dǎo)地位。通過對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，初步掌握了其生長特性，