融合蛋白IFN-IgGFc在乳酸桿菌和大腸桿菌中的表達(dá)及其生物學(xué)活性研究.pdf

1、乳酸菌是食品工業(yè)生產(chǎn)中重要的菌種之一，也是人體主要益生菌之一，被公認(rèn)為是安全的食品微生物(GRAS，Generally Recognized As Safe)。干擾素(Interferon，IFN)是病毒誘導(dǎo)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能。用乳酸菌表達(dá)有藥用價(jià)值的生物學(xué)活性多肽，是當(dāng)前國(guó)際上的研究熱點(diǎn)之一，對(duì)開發(fā)新的功能性食品具有廣闊的前景。 本論文應(yīng)用PCR方法將人干擾素IFN-α-2b基因與IgG Fc

2、基因連接，并引入一段柔性連接肽，構(gòu)建了融合蛋白基因IFN-IgG Fc，將融合蛋白基因克隆到原核表達(dá)載體中，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌和乳酸菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定，并研究了融合蛋白的生物學(xué)活性，本研究為基因工程乳酸菌及相關(guān)藥物的開發(fā)研究奠定了基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： 1.將IFN-IgG Fc基因克隆到質(zhì)粒pET30a中，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a/IFN-IgG Fc，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，確定了誘導(dǎo)表達(dá)最大量

3、目的蛋白的最佳條件，蛋白表達(dá)量占菌體蛋白總重量的30％。對(duì)融合蛋白IFN-IgG Fc的純化工藝進(jìn)行了研究，初步建立了離子交換純化工藝，純度可達(dá)90％以上。Western-Blot結(jié)果表明，純化后的干擾素融合蛋白對(duì)IFN-α-2b和IgG Fc兩種抗體都有免疫學(xué)反應(yīng)，ELISA測(cè)定結(jié)果顯示兩段多肽能夠保持各自的構(gòu)象。融合蛋白可誘導(dǎo)Wish細(xì)胞產(chǎn)生明顯的抗VSV病毒的作用，其比活性大于2.0×10<'5>IU/mg。 2.將融合蛋

4、白IFN-IgG Fc基因克隆到乳酸菌表達(dá)質(zhì)粒pSC111 AE中，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pSC111 AE/IFN-IgG Fc。用電轉(zhuǎn)化的方法將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化乳酸乳桿菌ATCC393，優(yōu)化了轉(zhuǎn)化條件。在乳桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，確定了最佳表達(dá)量時(shí)間。通過免疫學(xué)方法在表達(dá)上清液檢測(cè)出干擾素融合蛋白，ELISA測(cè)定表明兩段多肽能夠保持各自的構(gòu)象。基因工程乳酸菌表達(dá)的上清液可以誘導(dǎo)Wish細(xì)胞產(chǎn)生明顯的抗VSV病毒的活性，其比活性為1.71×10<