深海PAHs降解菌的多樣性分析及重要降解菌的分子生物學(xué)研究.pdf

1、多環(huán)芳烴(PAHs)是指分子中含有兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)的烴類(lèi)，在環(huán)境中持久存在，具有廣泛的毒性、致突變性、致癌性。該論文主要對(duì)近海及深海環(huán)境中的多環(huán)芳烴(PAHs)降解菌的多樣性和所分離獲得的重要PAHs降解菌進(jìn)行研究。 第一部分，近海菲降解菌的研究：以菲為唯一碳源和能源從廈門(mén)近海海水樣品中篩選到一株能夠降解多種PAHs的細(xì)菌。16SrDNA序列同源性分析表明它可能屬于新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobiumsp.phe-

2、8)。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定了該菌對(duì)菲、芘的降解率，發(fā)現(xiàn)：起始濃度為100mg/L的菲在三周內(nèi)幾乎完全被降解；起始濃度為10mg/L的芘在5d內(nèi)幾乎完全被降解。根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的PAHs起始雙加氧酶大亞基基因序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)簡(jiǎn)并引物，并PCR擴(kuò)增得到了約700bp的基因片段。比對(duì)結(jié)果顯示它同已報(bào)導(dǎo)的一株降解菌NovosphingobiumaromaticivoransF199質(zhì)粒上的bphAlf基因相似度最高，達(dá)到98.26％，該基因編

3、碼的蛋白推斷是萘或聯(lián)苯雙加氧酶大亞基。以PCR產(chǎn)物為模板制備DNA探針，Southern雜交表明：該基因位于其質(zhì)粒DNA上。 第二部分，西太平洋深海沉積物中芘降解細(xì)菌的研究：從西太平洋深海沉積物富集得到一個(gè)芘降解菌群并從該菌群中分離、鑒定了一株關(guān)鍵降解菌。以萘作為揮發(fā)性碳源，從菌群中分離得到了一株萘降解菌P1。16SrDNA序列分析證明該菌為解環(huán)菌(Cycloclasticussp.)，與其他已知種的相似性都在99％以上。碳源

4、范圍研究發(fā)現(xiàn)，它可以利用的PAHs包括：萘、2-甲基萘、2，6-二甲基萘、苊、菲、蒽、芴、氧芴、硫芴、芘、聯(lián)苯；但是它不能利用熒蒽、chrysene和苯并芘作為碳源。此外，它也不能利用苯、甲苯與二甲苯及常見(jiàn)的PAH降解中間物作為碳源；但是可以在乙酸鈉、丙酸鈉、L-谷氨酸鈉為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。P1在碳源利用方面跟解環(huán)菌屬其他已知種有很多差別，其中最重要的差別是它能夠利用芘作為唯一碳源和能源生長(zhǎng)。這也是目前唯一報(bào)道的來(lái)自深海的芘降解菌。通

5、過(guò)設(shè)計(jì)引物、PCR擴(kuò)增從其基因組DNA中克隆得到了兩個(gè)基因片段，分別包括：編碼PAHs起始雙加氧酶ISP組分大、小亞基的兩個(gè)基因和編碼鐵氧還蛋白、鐵氧還蛋白還原酶的兩個(gè)基因。1.9K的PCR擴(kuò)增片段與A5中同源片段的整體相似度為98.85％；而1.4K的擴(kuò)增片段與A5中同源片段的整體相似度為99.7％。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和P1的碳源利用特性分析，這些基因編碼的酶可能并不參與芘的降解，而極有可能含有其他降解酶基因。 第三部分，大西洋沉

6、積物中PAHs降解菌的研究：以PAHs混合物(萘、菲、芘)為碳源富集得到了5個(gè)不同的PAHs降解菌群。采用DGGE(16SrDNA的V3區(qū)序列)、單菌篩選、平板菌落計(jì)數(shù)相結(jié)合的方法對(duì)這些菌群的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析。通過(guò)單菌和菌群的DGGE條帶對(duì)應(yīng)，確定可培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)菌主要有：跟Pseudoalteromonasganghwensis、Novosphingobiumpentaromativorans、Marinobacterkoreensis、Ma

7、rinobactervinulentu、Halomonasmeridiana、Alcanivoraxvenusti、Alcanivoraxdieselolei、Tistrellamobilis、Thalassospiralucentensis近緣的菌種，其中Pseudoalteromonas、Novosphingobium、Marinobacter、Halomonas屬的細(xì)菌都有報(bào)道過(guò)的PAHs降解菌。Alcanivorax屬的細(xì)菌是報(bào)

8、道過(guò)的非常重要的烷烴降解菌。而跟Tistrellamobilis、Thalassospiralucentensis近緣的菌種則沒(méi)有PAHs降解的有關(guān)報(bào)道。同時(shí)對(duì)DGGE圖譜中沒(méi)有和已分離單菌對(duì)應(yīng)的菌群條帶進(jìn)行回收測(cè)序，確定的未培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)菌主要有：解環(huán)菌屬、食烷菌屬的多株細(xì)菌、跟Thalassospiralucentensis、Alteromonaslitorea、Marinobactersediminum、aarinobacteriumg