大別山野葛HPLC指紋圖譜庫的構(gòu)建及其植物化學物對乙醇神經(jīng)毒性保護作用的研究.pdf

1、葛根總黃酮對酒精所致小鼠中樞的抑制作用研究旨在建立中藥指紋圖譜的基礎(chǔ)上，展示成分群特征峰與藥效結(jié)果的對應(yīng)關(guān)系，即中藥的“譜效”關(guān)系，建立中藥產(chǎn)品與其療效基本一致的反映產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量的標準，也是發(fā)展中藥現(xiàn)代化、國際化的關(guān)鍵。 第一部分大別山野葛HPLC指紋圖譜庫的構(gòu)建 方法：Agilent1100高效液相色譜儀；色譜柱為ZorbaxXDB-C18(4.6mmx250mm，5xμm，Agilent公司)；流動相為甲醇-水，梯度

2、洗脫，0-60min甲醇濃度由25％上升到100％;流速為0.5mL/min；檢測波長為250nm；進樣量為20uL;柱溫25℃。分別制備葛根素標準品溶液和各樣品溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。分析野葛色譜圖的指紋特征。 結(jié)果：1.此方法的線性關(guān)系良好線性，回歸方程：Y=136.42X+148.08相關(guān)系數(shù)r=0.9999，精密，穩(wěn)定，回收率高。 2.葛根藥材中所含黃酮類成分均得到了很好的分離，HPLC指紋圖譜顯示有1

3、0個共有峰，各供試品間各共有峰相對保留時間RSD％＜5％，各共有峰相對峰面積RSD％＜10％，共有峰總面積占總峰面積的平均百分比為95.68％，RSD％為1.22％。 討論：1.本實驗采用甲醇-水梯度洗脫法建立的HPLC指紋圖譜，可以用來評價和控制野葛的內(nèi)在質(zhì)量。 2.提高和穩(wěn)定原料藥材質(zhì)量，建立原料藥材的HPLC指紋圖譜是控制葛四川大學博士學位論文根等中藥內(nèi)在質(zhì)量的有效方法。第二章大別山野葛HPLC指紋圖譜庫的構(gòu)建本章

4、采用高效液相色譜法研究不同季節(jié)、不同部位、不同年輪、不同朝向及多級提取工藝的不同階段的野葛及其產(chǎn)品的HPLC指紋圖譜，首次構(gòu)建了大別山野葛HPLC指紋圖譜庫，為野葛藥材的質(zhì)量控制提供標準，為這一藥材的合理采收和開發(fā)利用提供科學依據(jù)。 方法：采用第一章中建立的方法學分析不同季節(jié)，不同部位，不同年輪，不同朝向以及多級提取工藝的不同階段的野葛色譜圖的指紋特征。結(jié)果：1.不同季節(jié)的野葛藥材HPLC指紋圖譜比較相似，各共有峰都存在，但各共

5、有峰之間的相對峰面積并不相同，RSD％范圍在0.92％-17.42％;共有峰總面積百分比和葛根素含量平均值均以以春季最高，分別為94.73％和4.01％。 2.近根藤和遠根藤的HPLC指紋圖譜與根部相比較，存在一定的相似性，各共有峰都存在，但各共有峰之間的相對峰面積并不相同，RSD％范圍在0.58％-16.09％之間；共有峰總面積百分比和葛根素含量平均值根部含量明顯高于其他部位，分別為95.68％和4.78％。 5.多級

6、提取工藝的不同階段所得的同一品種的野葛藥材HPLC指紋圖譜存在一定程度的差別。共有峰并不完全相同，共有峰總面積，葛根素峰峰面積以及葛根素含量均以乙醇提取物最高。 討論：1.不同季節(jié)的野葛藥材存在內(nèi)在質(zhì)量的差別，春季為最佳采收季節(jié)。 2.野葛藥材不同部位可利用價值明顯的不同，在開發(fā)利用這一資源時，主要選擇葛根作為原材料。 3.生長年限對葛根素含量影響較明顯，為提高資源利用度，應(yīng)選擇生長年限較長的野葛作為原材料。

7、 4.陽坡采集的藥材葛根素含量明顯高于陰坡采集的藥材，為了提高資源的利用度，應(yīng)選擇陽坡藥材作為開發(fā)野葛的原材料。 5.用無水乙醇索氏提取是今后進行HPLC葛根指紋圖譜分析，資源加工利用的較好的提取方法。 第三章利用HPLC指紋圖譜技術(shù)探討傳統(tǒng)加工工藝中葛根資源利用度自然資源的利用，涉及國計民生、節(jié)約資源和社會和諧。目前，全國生態(tài)形勢很嚴峻。一方治理，多方破壞；點上治理，面上破壞，呈現(xiàn)四川大學博士學位論文出生態(tài)破壞范圍

8、在擴大、程度在加劇、危害在加重的勢態(tài)。 。 方法：取葛根傳統(tǒng)加工工藝中的上層廢漿液及葛根淀粉按第一章所確定的方法，分別作做HPLC指紋圖譜。 結(jié)果：在大別山葛根HPLC指紋圖譜的10個共有峰中，廢漿液HPLC指紋圖譜存在8個共有峰，其中第5和第7個峰不存在，葛根廢漿液中共有峰峰面積百分比高達97.83％；葛根素峰峰面積百分比高達71.08％。葛根淀粉的HPLC指紋圖譜中僅存在葛根素峰，其中的葛根素含量卻極微量，僅為0.0

9、5％。 討論：葛根淀粉傳統(tǒng)加工工藝對葛根資源的利用極不合理，表現(xiàn)在其終端產(chǎn)品——葛根淀粉成分單一；廢漿液中的成分群構(gòu)成接近葛根中的成分群構(gòu)成，是經(jīng)濟價值很高的資源；廢棄的葛根纖維渣，將是良好的造紙原料和生態(tài)建筑材料。對自然資源的利用，應(yīng)該以科學的發(fā)展觀，遵循循環(huán)經(jīng)濟的原則，采取綜合措施合理利用。 第二部分 野葛粗提物及其主要成分葛根素改善乙醇神經(jīng)毒性作用的研究四川大學博士學位論文葛根用于解酒已有悠久的歷史。葛根在唐代已

10、用來“解酒毒”。 。 第一章乙醇對胚胎期小鼠海馬細胞毒性作用的研究 氧化應(yīng)激在酒精所致各種疾病的發(fā)生與發(fā)展過程中所起作用越來越受到重視。發(fā)育期的神經(jīng)系統(tǒng)，特別是海馬組織對乙醇的毒性作用尤為敏感，對其作用機制的研究目前多以胚胎期大鼠海馬細胞體外培養(yǎng)為模型。一般認為，毒作用劑量的乙醇對發(fā)育期神經(jīng)系統(tǒng)的影響，主要是通過影響神經(jīng)元細胞的增殖活力而實現(xiàn)的。另外，乙醇是一種能引起細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的小分子物質(zhì)，可快速調(diào)節(jié)機體的氧化過程

11、和改變一些功能蛋白的表達和生理活性。 方法：海馬細胞的培養(yǎng)取材于孕18天ICR胎鼠。用MTT法檢測細胞活力，并采用RT-PCR和WesternBlot方法觀察HSP70和SODmRNA及蛋白質(zhì)表達的變化。 結(jié)果：1.用MTT方法檢測細胞活力顯示，在50-350mol/L的范圍內(nèi)，乙醇抑制海馬細胞的增殖活力呈現(xiàn)良好的劑量—效應(yīng)關(guān)系；與對照組相比，在100，200及350mol/L的乙醇濃度條件下，細胞增殖活力分別為對照組的

12、55％、44％及17％(P＜0.05)。 2.半定量RT-PCR技術(shù)檢測結(jié)果表明，在50～350mol/L濃度范圍內(nèi)，與對照組相比，乙醇對胎鼠海馬細胞處理24h可顯著性促進HSP70及SODmRNA表達的影響. 3.采用Western-blot技術(shù)檢測了乙醇在50～350mol/L濃度范圍內(nèi)對HSP70及SOD蛋白表達的影響。資料顯示，在該濃度范圍內(nèi)，乙醇可明顯促進HSP70及SOD蛋白的表達。 討論：1.研究表

13、明，與對照組相比，在100，200及350mol/L的乙醇濃度條件下，細胞增殖活力分別為對照組的55％、44％及17％(P＜0.05)。提示，在該濃度范圍內(nèi)，乙醇對海馬細胞具有明顯的神經(jīng)毒性作用，以此作為乙醇所致神經(jīng)組織海馬細胞氧化應(yīng)激損傷的體外試驗模型。 2.實驗結(jié)果表明，乙醇可刺激海馬細胞HSP70的表達，且具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。證實海馬區(qū)是乙醇毒性作用的敏感區(qū)；孕期飲酒所造成的四川大學博士學位論文神經(jīng)系統(tǒng)損傷與海

14、馬區(qū)發(fā)育受到影響有密切關(guān)系；熱休克蛋白具有保護乙醇所致的損傷作用。 3.乙醇可誘導SODmRNA和蛋白質(zhì)的表達，說明這種保護作用的調(diào)節(jié)不僅發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平而且發(fā)生在翻譯水平。乙醇可導致海馬組織損傷，機體的保護作用涉及到HSP70和SOD途徑的啟動。 第二章野葛粗提物及其主要成分葛根素對乙醇引起海馬神經(jīng)細胞毒性保護作用的研究研究資料證實，酒精所引起的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常主要與細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)失衡有關(guān)。酒精在代謝過程

15、中，產(chǎn)生大量具有神經(jīng)元毒性作用的活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)，并提高了周圍組織的脂質(zhì)過氧化作用。 ，本課題利用胎鼠海馬細胞培養(yǎng)體系，首次使用葛根粗提物(CP)及葛根素標準品(SP)，并結(jié)合第一部分已經(jīng)建立的HPLC指紋圖譜，從成分群和單一成分兩個角度觀察它們拮抗乙醇神經(jīng)毒性的效能，從中藥成分群指紋圖譜特征與其生物學活性的聯(lián)系上，建立“譜效”關(guān)系。 方法：四川大學博士學位論文海馬細胞的培養(yǎng)取材于孕

16、18天ICR胎鼠。用MTT法檢測細胞活力，并采用RT-PCR和WesternBlot方法觀察HSP70和SODmRNA及蛋白質(zhì)表達的變化。 結(jié)果：1.15mg/LCP和10mg/LSP均可部分拮抗50～350mol/l乙醇對胎鼠海馬細胞所產(chǎn)生的毒性作用。 2.15mg/LCP和10mg/L對海馬細胞預處理12h，這兩種物質(zhì)均可部分抑制乙醇所引起細胞HSP70表達的升高， 3.15mg/LCP和10mg/L均可降低