鈍頂節(jié)旋藻高濃度NH4HCO3耐受株誘變選育及二氧化碳濃縮機(jī)制相關(guān)基因表達(dá)分析.pdf

1、節(jié)旋藻(Arthrospira)被世界糧農(nóng)組織譽(yù)為21世紀(jì)人類最理想的食品,上世紀(jì)80年代已經(jīng)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化養(yǎng)殖。進(jìn)一步改良藻種種質(zhì),獲得在工業(yè)生產(chǎn)上具有優(yōu)良性狀的突變株,并深入了解與節(jié)旋藻光合作用密切相關(guān)的二氧化碳濃縮機(jī)制對(duì)于節(jié)旋藻養(yǎng)殖有著重要的意義。
　　 節(jié)旋藻正常生長(zhǎng)需要氮源和碳源,而適宜濃度的NH4HCO3可以同時(shí)為藻體提供氮源和碳源。而且利用氨水吸收工業(yè)廢氣中的CO2是新的發(fā)展趨勢(shì),有效的利用NH4HCO3對(duì)于節(jié)能減排有

2、重要意義。高濃度的NH4+還可以在節(jié)旋藻大規(guī)模養(yǎng)殖中對(duì)于原生動(dòng)物有殺滅作用。但是高濃度的NH4+對(duì)于正常生長(zhǎng)的藻體也會(huì)有傷害,因此有必要篩選能夠在高濃度NH4HCO3下可以生長(zhǎng)的鈍頂節(jié)旋藻。
　　 節(jié)旋藻的二氧化碳濃縮機(jī)制(CCM)在固碳過程中起著重要的作用。羧酶體是CCM機(jī)制的主要元件,ccmM及ccmO編碼了羧酶體包被蛋白相關(guān)基因:且CCM機(jī)制的關(guān)鍵酶之一-碳酸酐酶現(xiàn)在還未有報(bào)道,而ccmM基因編碼的蛋白其N-末端結(jié)構(gòu)域與γ

3、-碳酸酐酶相似。因此本論文還試圖通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)手段了解ccmM及ccmO基因的表達(dá)特性,以了解鈍頂節(jié)旋藻CCM機(jī)制的表達(dá)情況。
　　 本論文首先比較了紫外線、EMS、NTG三種不同誘變劑對(duì)于鈍頂節(jié)旋藻的誘變效果,選擇了NTG作為最適宜的誘變劑誘導(dǎo)鈍頂節(jié)旋藻發(fā)生突變。在0.022mol／1NH4HCO3的選擇壓下,篩選得到了8株能夠耐受高濃度NH4HCO3突變株。并比較了誘變前后藻株在高濃度NH4HCO3條

4、件下的生長(zhǎng)速率及光合速率。
　　 結(jié)果表明,0.004mol／l的NH4HCO3最有利于出發(fā)藻株的生長(zhǎng),在NH4HCO3濃度為0.022mol／l時(shí)達(dá)到出發(fā)株的耐受極限。在8株突變株中有5株突變株對(duì)于NH4HCO3的耐受性與出發(fā)藻株有顯著性差異。
　　 比較0.022mol／l NH4HCO3下各突變株的比生長(zhǎng)速率,可以知道2號(hào)突變株在0.004mol／l NH4+濃度時(shí),比生長(zhǎng)速率較出發(fā)藻株提高了29.3％,5、6、8

5、號(hào)突變株在400mg／l NH4+濃度時(shí),比生長(zhǎng)速率為正值,而同樣處理?xiàng)l件下出發(fā)株的比生長(zhǎng)速率為負(fù)值。說明在此濃度的選擇壓下,突變株可以存活而出發(fā)株不能存活。
　　 比較0.022mol／l NH4HCO3下各突變株的光合速率,發(fā)現(xiàn)2號(hào)突變株的最大凈光合速率在0.004mol／l NH4+濃度時(shí)出現(xiàn),為3.066×10-4nmol·h-1·cell-1,比出發(fā)藻株提高了14.8％,在160mg／lNH4+濃度時(shí)2號(hào)突變株的凈光合

6、速率比出發(fā)藻株提高了93.7％。4、5、6、8號(hào)突變株的最大凈光合速率都在0.008mol／l NH4+濃度時(shí)出現(xiàn),分別為2.883×10-4nmol·h-1·cell-1、3.027×10-4nmol·h-1·cell-1、2.969×10-4nmol·h-1·cell-1、3.310×10-4nmol·h-1·cell-1,比出發(fā)藻株分別提高了91.4％、101.00％、97.1％和119.79％。用生長(zhǎng)曲線檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這5株突變株有著

7、優(yōu)良的遺傳穩(wěn)定性。
　　 另一方面,本論文還用2％CO2通氣培養(yǎng)鈍頂節(jié)旋藻48hrs抑制CCM相關(guān)的誘導(dǎo)型基因的表達(dá),再通入含有低濃度CO2的空氣以誘導(dǎo)CCM相關(guān)的誘導(dǎo)型基因的表達(dá)。通過測(cè)定低碳誘導(dǎo)后鈍頂節(jié)旋藻光合效率變化情況確定CCM機(jī)制的作用情況；通過RT-PCR手段,研究低碳誘導(dǎo)后鈍頂節(jié)旋藻CCM機(jī)制相關(guān)的ccmM、ccmO基因的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果表明,鈍頂節(jié)旋藻經(jīng)低碳誘導(dǎo)后,光合效率有所降低,并在低碳誘導(dǎo)30

8、min后光合效率達(dá)到穩(wěn)定,說明低碳誘導(dǎo)30min后CCM機(jī)制就已經(jīng)穩(wěn)定發(fā)揮作用；通過RT-PCR手段,我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過低碳誘導(dǎo)以后,ccmM、ccmO基因的表達(dá)沒有顯著性變化,說明鈍頂節(jié)旋藻CCM機(jī)制在經(jīng)過短時(shí)間的低碳誘導(dǎo)以后,羧酶體的數(shù)目沒有顯著變化,且ccmM基因編碼的蛋白在藻體內(nèi)可能并不能起到碳酸酐酶的作用,在鈍頂節(jié)旋藻藻體內(nèi)可能還有另外的未發(fā)現(xiàn)的碳酸酐酶存在。
　　 綜上所述,本論文證明通過誘變劑誘發(fā)節(jié)旋藻的基因突變,并加以