兩頭尖抗肝纖維化作用及機理研究.pdf

1、第一部分兩頭尖總皂苷部位提取最佳工藝研究及制備
　　 目的：確定兩頭尖總皂苷部位提取最佳工藝，為后續(xù)藥理實驗提供所需實驗藥品。
　　 方法：采用竹節(jié)香附素A為對照品，以香草醛-冰醋酸法測定藥材中總皂苷的含量，以兩頭尖總皂苷的提取率為指標(biāo)，對回流、超聲和微波三種提取方法進(jìn)行比較，并采取正交實驗法對提取工藝進(jìn)行改進(jìn)，確定3個因素，即乙醇濃度(A)、提取時間(B)及溶媒比(C)，每因素設(shè)計3個水平，用L9(34)正交表進(jìn)行實驗

2、。
　　 結(jié)果：回流、超聲和微波三種提取方法的總皂苷提取率分別為2.30％、2.39％、3.69％。方差分析結(jié)果表明，A因素選1水平，B因素，C因素對結(jié)果變化無顯著性影響。
　　 結(jié)論：確定兩頭尖總皂苷最佳提取方法為，首先乙醚脫脂，接著乙醇微波提取，確定最佳條件為60％乙醇，10倍量，微波提取8min，30s為一個間隔；最后通過水飽和正丁醇萃取法進(jìn)一步精制。本次實驗用兩頭尖總皂苷得率為2.66％。
　　 第二部分

3、兩頭尖抗豬血清免疫大鼠肝纖維化模型的作用及機理研究
　　 目的：觀察兩頭尖原藥及兩頭尖提取物對豬血清免疫誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠的治療作用，旨在從組織病理、HSC活化、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)變化等方面考察其療效并進(jìn)而探討其作用機制。
　　 方法： SD大鼠68只隨機分為5組，即空白組、模型組、扶正化瘀組(以下簡稱扶正組)、兩頭尖原藥組(以下簡稱原藥組)、兩頭尖提取物組(以下簡稱提取組)。采用豬血清腹腔注射法制備大鼠肝纖維化模

4、型，0.5ml/只，每周2次，連續(xù)注射15周。第15周模型成功后，開始灌胃給藥，扶正組給予扶正化瘀膠囊(15.8g·kg-1)，原藥組給予兩頭尖煎液(0.7g·kg-1)，提取物給予兩頭尖提取物(0.071g·kg-1)，模型組與空白組灌服等量生理鹽水，日一次，療程8周。實驗過程中，定期稱重并記錄，觀察記錄動物行為學(xué)特征，記錄死亡情況。大鼠于第23周末處死取材，分光光度法測定血清ALT、AST、ALB、SOD、MDA含量與肝組織中羥脯氨

5、酸(Hyp)含量。ELISA法檢測血清中MMP-9含量；放免法檢測血清中HA、LN、PCⅢ、CⅣ含量；胍染色與Masson法檢測肝組織病理；免疫組化法(SABC法)測定肝組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)表達(dá)；RT-PCR技術(shù)測定肝組織中基質(zhì)金屬蛋白抑制酶-1(TIMP-1)mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：與模型組相比，扶正組、原藥組、提取物組可顯著改善大鼠一般身體狀況，且

6、體重變化有顯著差異(p<0.05)；HE染色與masson染色結(jié)果證實，模型組大鼠肝組織正常肝小葉結(jié)構(gòu)完全被破壞，肝索排列紊亂，在匯管區(qū)和肝小葉內(nèi)有大量纖維結(jié)締組織增生沉積，增多的膠原纖維形成線條狀纖維間隔，可見假小葉形成。部分肝細(xì)胞出現(xiàn)萎縮、腫脹變性，甚至點狀壞死，匯管區(qū)擴大，炎性細(xì)胞及壞死細(xì)胞增多。與模型組相比，扶正組、提取組、原藥組炎癥活動度、纖維化程度顯著減輕(p<0.05)。免疫組化結(jié)果表明，模型組肝組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、α

7、-SMA、TGF-β1多呈高水平表達(dá)，染色呈深褐色，面積彌漫；扶正組、原藥組、提取組表達(dá)面積和強度較模型組明顯為弱，纖維間隔染色淡，無典型假小葉形成。顯色指數(shù)結(jié)果表明，與模型組相比，扶正組、提取組、原藥組肝組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、α-SMA、TGF-β1的表達(dá)均明顯減少(p<0.05)，且原藥組α-SMA表達(dá)輕于扶正組(p<0.05)。模型組血清ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、CⅣ、MDA含量與肝組織Hyp含量明顯升高(p<0.0

8、5)，血清Alb、SOD、MMP-9含量明顯降低(p<0.05)。與模型組相比，除提取組LN，扶正組與提取組血清SOD含量差異無顯著性外，扶正組、原藥組、提取組血清ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、CⅣ、MDA含量與肝組織Hyp含量下降(P<0.05)，Alb、SOD、MMP-9含量升高(P<0.05)。肝組織中TIMP-1mRNA表達(dá)結(jié)果表明，模型組肝組織中TIMP-1mRNA表達(dá)增高(p<0.05)；與模型組相比，提取組肝組織中T

9、IMP-1mRNA表達(dá)降低(p<0.05)。
　　 結(jié)論：采用豬血清免疫法可成功制備肝纖維化大鼠模型，兩頭尖原藥及其提取物具有良好的抗肝纖維化作用，且提取物抗肝纖維化作用基本等同于兩頭尖原藥。推測其作用機制為：①抑制肝星狀細(xì)胞活化；②抑制ECM合成并促進(jìn)ECM降解；③抑制促纖維化細(xì)胞因子表達(dá)；④保護(hù)肝細(xì)胞、減輕肝臟炎癥；⑤抗脂質(zhì)過氧化損傷
　　 第三部分兩頭尖含藥血清對人肝星狀細(xì)胞LX-2增殖及Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、α-S

10、MA、TGF-β1表達(dá)的影響
　　 目的：觀察兩頭尖含藥血清對人肝星狀細(xì)胞增殖的影響并進(jìn)而探討其作用機理。
　　 方法： MTT比色法觀測兩頭尖含藥血清對人肝星狀細(xì)胞LX-2增殖的影響；應(yīng)用細(xì)胞免疫組化法觀察兩頭尖對人肝星狀細(xì)胞中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、α-SMA、TGF-β1表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：無論是兩頭尖原藥或是兩頭尖提取物含藥血清均對人肝星狀細(xì)胞增殖具有抑制作用，隨著濃度的增加，對LX-2增值的抑制作用也