姜黃素抑制肝星狀細胞Hedgehog信號通路抗肝纖維化作用研究.pdf

1、背景：
　　肝纖維化是各種慢性肝病的共同病理過程，當(dāng)今醫(yī)學(xué)界仍無有效的肝纖維化防治藥物。肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)活化并大量分泌細胞外基質(zhì)成分是肝纖維化病理過程中的核心事件。因而藥物抑制HSC活化是阻斷肝纖維化進程并逆轉(zhuǎn)肝纖維化的有效策略。新近研究發(fā)現(xiàn)，Hedgehog(Hh)信號通路的活化與肝纖維化病理進程高度相關(guān)，可能是全新的藥物干預(yù)靶標(biāo)。中藥活性成分已成為當(dāng)前抗肝纖維化候選藥物的重要來

2、源。本課題組對天然產(chǎn)物姜黃素在抗肝纖維化中的作用進行了長期研究，明確了姜黃素的體內(nèi)外抗肝纖維化活性，發(fā)現(xiàn)阻斷HSC胞內(nèi)促纖維化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是其抑制HSC活化的主要機制。在此基礎(chǔ)上，本論文提出姜黃素通過調(diào)控Hh通路抑制HSC活化從而發(fā)揮抗肝纖維化的科學(xué)假說并對此進行實驗研究。
　　方法：
　　本文運用Western blot和免疫熒光實驗檢測蛋白表達;ELISA實驗;Real-time PCR檢測mRNA的表達;Brdu摻入實

3、驗;流式細胞儀檢測細胞細胞周期和細胞凋亡實驗;EMSA實驗;油紅O染色實驗;Transwell小室實驗;細胞劃痕實驗;ATP水平檢測實驗;酶活力檢測;乳酸水平檢測;流式細胞儀檢測HSC細胞膜上Glut4的膜轉(zhuǎn)位等實驗方法。
　　結(jié)果：
　　我們首先建立CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型并給予姜黃素治療，發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠減少纖維化肝臟中Hh配體Shh的含量，下調(diào)Hh通路關(guān)鍵受體Patched和Smo的表達并上調(diào)Hh通路抑制因子Hhip

4、的表達;體外實驗發(fā)現(xiàn)，姜黃素除調(diào)控HSC中上述關(guān)鍵因子外，還抑制轉(zhuǎn)錄因子Gli1的核轉(zhuǎn)位、與靶基因的結(jié)合能力及靶基因的表達。我們使用Hh通路特異性拮抗劑環(huán)杷明和激動劑SAG考察姜黃素調(diào)控Hh通路與抑制HSC活化的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，環(huán)杷明與姜黃素一樣，均能抑制HSC增殖，阻滯細胞周期于G0/G1期，誘導(dǎo)HSC凋亡，恢復(fù)脂滴積聚并上調(diào)脂質(zhì)基因的表達，減少纖維化標(biāo)志物的表達，并抑制HSC的侵襲與遷移能力;而SAG則能削弱姜黃素的這些作用。

5、r>　　活化的HSC轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋衬芰軓姷募〕衫w維樣細胞時，細胞內(nèi)的能量代謝方式可能依賴于糖酵解途徑并且與其活化存在一定關(guān)聯(lián)。我們發(fā)現(xiàn)，以糖酵解抑制劑2DG和乳酸脫氫酶抑制Galloflavin分別干擾糖酵解過程的不同環(huán)節(jié)，均顯著降低HSC中纖維化標(biāo)志物的表達，恢復(fù)脂滴積聚并上調(diào)脂質(zhì)基因的表達，這提示糖酵解活性的上調(diào)可能是維持HSC活化重要條件。在此基礎(chǔ)上，我們體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)姜黃素對HSC中糖酵解過程中一些列關(guān)鍵分子的表達具有抑制作用;環(huán)