白木香結(jié)香前后內(nèi)生菌的多樣性分析.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:白木香Aquilaria sinensis(Lour.) Gilg,又稱土沉香、女兒香,來源于瑞香科沉香屬。白木香是我國傳統(tǒng)中藥沉香的唯一源植物,已經(jīng)被列為國家二級瀕危保護植物。國產(chǎn)沉香是白木香受物理化學的損傷或某些生物的刺激而產(chǎn)生的含樹脂的木材,是傳統(tǒng)名貴中藥材和天然香料,具有很高的藥用價值和商業(yè)價值,但其自然積累過程需要漫長的數(shù)十年,且品質(zhì)不可控。沉香形成過程及其結(jié)香機制至今尚未完全研究透徹,導致實際生產(chǎn)中尚無高效優(yōu)質(zhì)的人工結(jié)

2、香手段,同時源植物資源一直被掠奪式開發(fā),因此市場上沉香供不應求、價格居高不下。已有不少研究證實沉香的形成與內(nèi)生菌的感染有關,但其研究思路都是依托實驗室培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法。本研究采用分子生物學方法,PCR-變性梯度凝膠電泳即PCR-DGGE(Denaturing gradient gelelectrophoresis,DGGE)技術,以及末端限制性片段長度多樣性即T-RFLP(Terminal-restriction fragment len

3、gth polymorphism, T-RFLP)技術對比白木香未結(jié)香白木及結(jié)香部位內(nèi)生菌的菌落結(jié)構及多樣性,探討內(nèi)生菌對白木香結(jié)香的影響,為開發(fā)更多更好的促進結(jié)香的微生物提供科學依據(jù)。
  方法:⑴為了避免外源性微生物的污染,用已消毒的生長錐去掉取材部位的表層,取材后迅速放入已滅菌的采集袋,運輸回實驗室-20℃保存?zhèn)溆?。⑵將各個樣品在超凈臺表面消毒后無菌環(huán)境晾干。用滅菌刀片刮去樣品表層組織,以防止外源性微生物DNA的污染,保證提

4、取的核酸來自植物組織內(nèi)部;同時剃除結(jié)香組樣品連帶的健康白木部分,保證結(jié)香組提取的微生物DNA來源于沉香。將處理好的樣品無菌環(huán)境液氮研末,置于無菌離心管備用。⑶各樣品總DNA提取采用植物基因組DNA提取試劑盒進行,具體操作參考按試劑盒使用說明。⑷提取的總DNA點樣于1%的瓊脂糖凝膠,電泳檢測其片段大小,并用核酸蛋白儀測定DNA的濃度及質(zhì)量。⑸以樣品總DNA(稀釋液)為模板,擴增引物都采用通用引物,且上游引物帶上GC夾,PCR完成后,產(chǎn)物1

5、.5%瓊脂糖凝膠檢測,合格后進行DGGE電泳,掃描凝膠得到DGGE圖譜,合格后選取條帶編號割膠回收,回收條帶擴增產(chǎn)物直接送檢測序。⑹以樣品總DNA(稀釋液)為模板,分別采用帶有FAM熒光基團的細菌和真菌通用引物進行擴增。擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,割膠回收后膠回收試劑盒進行純化。純化后的PCR產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶進行酶切。酶切產(chǎn)物委托上?;瞪锛夹g有限公司進行熒光掃描。
  結(jié)果:無論是結(jié)香組還是未結(jié)香組,DGGE都分離得

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