蘇云金芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶chi9602突變體的表達及初步晶體學研究.pdf

1、幾丁質(zhì)酶屬于糖基水解酶家族的一種，其分子大小因物種的不同而不同。幾丁質(zhì)酶能催化幾丁質(zhì)水解成為N-乙酰氨基葡萄糖和幾丁寡糖。隨著幾丁質(zhì)酶在農(nóng)業(yè)和工業(yè)方面的重要應用，特別是植物真菌防治，植物病原害蟲的防治，農(nóng)業(yè)殺蟲劑的研發(fā)，幾丁寡糖的生產(chǎn)，單細胞蛋白的生產(chǎn)，因而引起了研究人員越來越多的重視。
　　在本研究中，將經(jīng)過分子定向改造的蘇云金芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶基因chitinase連接在載體pET-28a(+)上構建新的表達載體，然后將構建的載

2、體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，分別針對pET-28a(+)-chitinase和pTrcHisB-chitinase進行表達條件的優(yōu)化（誘導劑濃度，誘導溫度，誘導時間），最終確定了目的蛋白的最佳表達條件：pET-28a(+)-chitinase在E.coli BL21(DE3)中的最佳表達條件為：0.1mM IPTG，16oC，16h；pTrcHisB-chitinase在E.coli TOP10中的最佳表達條件為：1

3、mM IPTG，28oC，6h。接著在最佳的表達條件下誘導目的蛋白大量表達，并通過Western blot驗證了表達的蛋白是目的蛋白。隨后通過親和層析、凝膠層析等一系列純化，獲得了大量高純度的幾丁質(zhì)酶。對幾丁質(zhì)酶進行了酶活性的測定：pET-28a(+)-chitinase的比酶活為71U/mg，pTrcHisB-chitinase的比酶活為68U/mg。并分別通過圓二色譜檢測表明幾丁質(zhì)酶在兩種不同載體上表達時，二級結構發(fā)生了一定的變化。