蘇云金芽孢桿菌融合蛋白.pdf

1、隨著生物科學(xué)的發(fā)展，蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)殺蟲蛋白已廣泛用于農(nóng)業(yè)害蟲的防治。但是由于Bt蛋白殺蟲譜較窄，加之近年來害蟲抗性問題的產(chǎn)生，嚴(yán)重影響B(tài)t應(yīng)用和發(fā)展。為了更好的抵抗害蟲抗性的產(chǎn)生，通過構(gòu)建Bt融合蛋白，來擴(kuò)大殺蟲譜，提高殺蟲毒力。
　　 已有研究發(fā)現(xiàn)：(1)晶體蛋白Cry1Ac與Vip3Aa18蛋白具有不同的殺蟲譜。Cry1Ac蛋白對(duì)棉鈴蟲(Heliothis armig

2、era)最具殺蟲毒力，Vip3Aa18蛋白對(duì)甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)最具殺蟲毒力。而Cry1Ac蛋白對(duì)甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)，Vip3Aa18對(duì)棉鈴蟲（Heliothisarmigera）均毒力較差。(2)二者具有不同的殺蟲機(jī)理。Vip3Aa蛋白與Cry晶體蛋白所結(jié)合的特異性受體及造成穿孔的具體機(jī)制不同。因此，通過基因重組技術(shù)，構(gòu)建Cry1Ac-Vip3Aa18融合蛋白，期望該融合蛋白能夠兼

3、具二者殺蟲毒力，擴(kuò)大殺蟲譜，減緩害蟲抗性發(fā)生。
　　 本實(shí)驗(yàn)，采用pET-28a(+)作為表達(dá)載體，通過NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)將編碼Cry1Ac三結(jié)構(gòu)域核心片段的基因cry1AcT連接到本實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒pET-28a(+)-vip成功構(gòu)建pET-28a(+)-cy1AcT-vip質(zhì)粒。轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21-pLysS菌株誘導(dǎo)表達(dá)，通過western blotting確定分子量大小155kDa的蛋白為融合蛋白Cry1AcT

4、-Vip3A。用同樣的方法將α-1螺旋缺失的Cry1Ac三結(jié)構(gòu)域片段和Vip3A全長蛋白構(gòu)建成融合蛋白Cry1AcM-Vip3A，對(duì)融合蛋白毒力特性進(jìn)行研究。
　　 通過配體印記（ligand blotting）驗(yàn)證融合蛋白Cry1AcT-Vip3A與棉鈴蟲BBMV和甜菜夜蛾BBMV均具有很好的結(jié)合能力，并且融合蛋白與甜菜夜蛾BBMV結(jié)合片段大小與Vip3Aa18一致，與棉鈴蟲BBMV結(jié)合片段大小與Cry1Ac一致。因此推測：融

5、合蛋白在昆蟲中腸內(nèi)被酶解成Cry1AcT和Vip3Aa18，兩種蛋白各自發(fā)揮其殺蟲活性。
　　 以vip3A蛋白和Cry1Ac蛋白作為對(duì)照，采用本實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)的農(nóng)業(yè)害蟲甜菜夜蛾、棉鈴蟲的初孵幼蟲，對(duì)兩個(gè)融合蛋白進(jìn)行殺蟲生物活性測定。結(jié)果顯示，Vip3A蛋白對(duì)甜菜夜蛾的半致死濃度(LC50)為20.4ng/cm2，對(duì)棉鈴蟲的半致死濃度(LC50)為500ng/cm2以上；Cry1Ac蛋白對(duì)甜菜夜蛾的半致死濃度(LC50)為500

6、ng/cm2以上，對(duì)棉鈴蟲的半致死濃度(LC50)為6.0ng/cm2;而融合蛋白Cry1AcT-Vip3A對(duì)甜菜夜蛾的半致死濃度為19.3ng/cm2，對(duì)棉鈴蟲為7.7ng/cm2。說明該融合蛋白同時(shí)具備了Vip3A和Cry1Ac蛋白的殺蟲毒力，能夠同時(shí)對(duì)兩種害蟲具有高效殺蟲活性，擴(kuò)大了殺蟲譜。然而，α-1螺旋缺失的融合蛋白Cry1AcM-Vip對(duì)敏感昆蟲甜菜夜蛾、棉鈴蟲的半致死濃度分別為162ng/cm2，621ng/cm2，對(duì)敏感