蘇云金芽孢桿菌融合蛋白.pdf

1、隨著生物科學的發(fā)展，蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)殺蟲蛋白已廣泛用于農業(yè)害蟲的防治。但是由于Bt蛋白殺蟲譜較窄，加之近年來害蟲抗性問題的產生，嚴重影響B(tài)t應用和發(fā)展。為了更好的抵抗害蟲抗性的產生，通過構建Bt融合蛋白，來擴大殺蟲譜，提高殺蟲毒力。
　　 已有研究發(fā)現(xiàn)：(1)晶體蛋白Cry1Ac與Vip3Aa18蛋白具有不同的殺蟲譜。Cry1Ac蛋白對棉鈴蟲(Heliothis armig

2、era)最具殺蟲毒力，Vip3Aa18蛋白對甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)最具殺蟲毒力。而Cry1Ac蛋白對甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)，Vip3Aa18對棉鈴蟲（Heliothisarmigera）均毒力較差。(2)二者具有不同的殺蟲機理。Vip3Aa蛋白與Cry晶體蛋白所結合的特異性受體及造成穿孔的具體機制不同。因此，通過基因重組技術，構建Cry1Ac-Vip3Aa18融合蛋白，期望該融合蛋白能夠兼

3、具二者殺蟲毒力，擴大殺蟲譜，減緩害蟲抗性發(fā)生。
　　 本實驗，采用pET-28a(+)作為表達載體，通過NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點將編碼Cry1Ac三結構域核心片段的基因cry1AcT連接到本實驗室保存的質粒pET-28a(+)-vip成功構建pET-28a(+)-cy1AcT-vip質粒。轉入大腸桿菌BL21-pLysS菌株誘導表達，通過western blotting確定分子量大小155kDa的蛋白為融合蛋白Cry1AcT

4、-Vip3A。用同樣的方法將α-1螺旋缺失的Cry1Ac三結構域片段和Vip3A全長蛋白構建成融合蛋白Cry1AcM-Vip3A，對融合蛋白毒力特性進行研究。
　　 通過配體印記（ligand blotting）驗證融合蛋白Cry1AcT-Vip3A與棉鈴蟲BBMV和甜菜夜蛾BBMV均具有很好的結合能力，并且融合蛋白與甜菜夜蛾BBMV結合片段大小與Vip3Aa18一致，與棉鈴蟲BBMV結合片段大小與Cry1Ac一致。因此推測：融

5、合蛋白在昆蟲中腸內被酶解成Cry1AcT和Vip3Aa18，兩種蛋白各自發(fā)揮其殺蟲活性。
　　 以vip3A蛋白和Cry1Ac蛋白作為對照，采用本實驗室人工飼養(yǎng)的農業(yè)害蟲甜菜夜蛾、棉鈴蟲的初孵幼蟲，對兩個融合蛋白進行殺蟲生物活性測定。結果顯示，Vip3A蛋白對甜菜夜蛾的半致死濃度(LC50)為20.4ng/cm2，對棉鈴蟲的半致死濃度(LC50)為500ng/cm2以上；Cry1Ac蛋白對甜菜夜蛾的半致死濃度(LC50)為500

6、ng/cm2以上，對棉鈴蟲的半致死濃度(LC50)為6.0ng/cm2;而融合蛋白Cry1AcT-Vip3A對甜菜夜蛾的半致死濃度為19.3ng/cm2，對棉鈴蟲為7.7ng/cm2。說明該融合蛋白同時具備了Vip3A和Cry1Ac蛋白的殺蟲毒力，能夠同時對兩種害蟲具有高效殺蟲活性，擴大了殺蟲譜。然而，α-1螺旋缺失的融合蛋白Cry1AcM-Vip對敏感昆蟲甜菜夜蛾、棉鈴蟲的半致死濃度分別為162ng/cm2，621ng/cm2，對敏感