蘇云金芽孢桿菌WB50菌株vip3A基因和幾丁質(zhì)酶基因的定位.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是研究最為深入、使用最為廣泛的一種殺蟲微生物,在生物防治中占有極其重要的地位.營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白(VegetativeInsecticidal Proteins,VIPs)是一種在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期分泌的活性蛋白,主要分為VIP1、VIP2和VIP3三類,其中,VIP3A對(duì)鱗翅目昆蟲具有較廣譜的殺蟲活性,甚至能毒殺一些對(duì)Bt殺蟲晶體蛋白有很強(qiáng)抗性的昆蟲.幾丁質(zhì)酶能夠分解作為真菌細(xì)胞

2、壁和昆蟲圍食膜主要成分的幾丁質(zhì),具有重要的生防價(jià)值.研究蘇云金桿菌VIP3A、幾丁質(zhì)酶對(duì)開(kāi)發(fā)Bt新資源、改良Bt制劑具有重要意義.Bt基因定位研究可以拓寬Bt殺蟲譜,增強(qiáng)殺蟲活性.確定了基因在基因組中的位置后,即可對(duì)該基因所在的質(zhì)?；蛉旧w進(jìn)行限制性酶譜的構(gòu)建以及全序列的測(cè)定,有助于發(fā)現(xiàn)新的基因、研究基因之間的互作關(guān)系和表達(dá)調(diào)控機(jī)制.該研究對(duì)Bt編碼VIP3A、幾丁質(zhì)酶的基因進(jìn)行了克隆和定位.主要研究結(jié)果如下:一、對(duì)常規(guī)的三種提取Bt質(zhì)

3、粒DNA的方法進(jìn)行了比較.煮沸裂解法提取的質(zhì)粒DNA雜質(zhì)多,只能作為粗略檢測(cè)的模板;BGSC法適合于提取分子量較大的質(zhì)粒DNA;用常規(guī)堿裂解法所得的質(zhì)粒DNA條帶不全,大質(zhì)粒缺失,且重復(fù)性差,不適合作Southern雜交的模板DNA.該研究摸索出一種適合于提取Bt質(zhì)粒的改良?jí)A裂解法,該法提取的質(zhì)粒DNA條帶清晰、無(wú)拖尾,譜帶齊全,且質(zhì)粒DNA純度高,產(chǎn)物可直接用于限制性內(nèi)切酶消化、PCR擴(kuò)增等分析,滿足Southern雜交的對(duì)模板純度較

4、高的要求.二、克隆了WB50的vip3A基因并在GenBank上登錄(登錄號(hào)AY295778).根據(jù)GenBank上已知的Bt vip3A基因序列(登錄號(hào):L48811),設(shè)計(jì)出擴(kuò)增vip3A基因的一對(duì)含NotI和XhoI酶切位點(diǎn)的引物VCL1/VCL2,以WB 50的質(zhì)粒DNA為模板,利用PCR擴(kuò)增出vip3A基因序列.將PCR產(chǎn)物純化回收后連接到克隆載體pMD18-T上,用CaCl2轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到受體菌Escherichia coli

5、 JM109中,在X-gal、IPTG平板上挑選若干個(gè)白色菌落,進(jìn)行限制性酶切和PCR分析,驗(yàn)證陽(yáng)性克隆子并測(cè)序.測(cè)序結(jié)果經(jīng)在線的Blast軟件進(jìn)行同源性分析表明:與其高度同源的基因均為vip3A基因,同源性高達(dá)99％以上,該基因在GenBank上的登錄號(hào)為AY295778.三、WB50菌株vip3A基因定位.WB50菌株的vip3A基因是從質(zhì)粒DNA中克隆得到的,初步推測(cè)vip3A基因定位于質(zhì)粒上.為進(jìn)一步驗(yàn)證此推測(cè)以及精確定位該基因

6、,將質(zhì)粒DNA各條帶純化、回收,PCR分別擴(kuò)增vip3A基因,結(jié)果表明,vip3A基因不定位在小于23 kb的質(zhì)粒上.以染色體DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,未得到目的片段,確定染色體DNA不編碼vip3A基因.以vip3A基因468 bp的片段作探針,對(duì)WB50的質(zhì)粒和染色體DNA進(jìn)行Southern雜交,結(jié)果表明,該基因定位于31.8 kb的質(zhì)粒上.四、WB50菌株chi基因定位.該研究從Bt菌株WB50的總DNA和染色體DNA中擴(kuò)增出