杜仲防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松及其機(jī)理研究.pdf

1、研究背景：
　　中年以后，生理性退行性改變所致的骨質(zhì)疏松(osteoporosis,OP)的發(fā)病率隨年齡的增長而增加，以骨量減少、骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化，骨脆性增高，誘發(fā)骨折為特征。OP是一個全球性的健康問題，嚴(yán)重影響中老年人的生活質(zhì)量。雌激素在OP的發(fā)生過程中起著極其重要的作用，尤其是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausalosteoporosis,PMO)，因此，激素替代療法(hormonereplacementtherap

2、y,HRT)一直被視為是防治PMO的有效手段。婦女健康倡議研究結(jié)果顯示，HRT的長期應(yīng)用具有增加患者的心血管意外事件和生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重限制了HRT在PMO預(yù)防和治療中的應(yīng)用。其它的抗骨質(zhì)疏松藥物，包括促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收的藥物，雖然具有確切的PMO預(yù)防或者治療作用，但是長期服用不僅其價(jià)格昂貴，而且可能產(chǎn)生副作用。因此，迫切需要尋找安全、有效的防治OP的藥物，更好地克服現(xiàn)有藥物存在的問題。
　　臨床實(shí)踐證明，許多天然藥

3、物可以有效、安全地防治與OP相類似的臨床癥狀。某些植物富含許多天然植物化學(xué)物質(zhì)，這些物質(zhì)具有重要的生理活性。大豆異黃酮是天然的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(selectiveestrogenreceptormodulators,SERMs)，其對骨組織藥理作用類似于雷洛昔芬，能夠防止絕經(jīng)婦女或卵巢切除(ovariectomy,OVX)大鼠的骨丟失。近年來，植物中所富含的多酚類物質(zhì)也引起了研究者的關(guān)注。木脂素類，如從亞麻子中分離得到的閉聯(lián)異松樹

4、脂醇二酯能夠有效的防治婦女絕經(jīng)導(dǎo)致的骨質(zhì)丟失的發(fā)生；從紅豆杉中分離得到的異紫杉脂素在動物OVX后能有效延緩骨質(zhì)丟失；從紅楠中分離的木脂素類能夠顯著的促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞(osteoblast,OB)的增殖和分化。此外，也有研究顯示黃酮類如蘆丁能夠有效的抑制絕經(jīng)大鼠骨量的減少和骨強(qiáng)度的下降，可能與其抑制骨吸收和促進(jìn)骨形成有關(guān)。
　　研究目的：
　　杜仲是一富含木脂素、酚酸和黃酮類等化學(xué)物質(zhì)的天然“補(bǔ)腎”良藥，其防治與OP相類似的臨

5、床癥狀的骨癥已有千余年的歷史。因此，本課題在復(fù)制OVX大鼠骨質(zhì)疏松模型的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)地研究了杜仲防治PMO作用；發(fā)掘、分離得到重要活性成分——杜仲總木脂素；體外培養(yǎng)大鼠原代成骨細(xì)胞，在細(xì)胞水平上對藥物活性成分進(jìn)行研究，分析杜仲防治PMO的物質(zhì)基礎(chǔ)及其機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.選取3月齡未經(jīng)產(chǎn)雌性二級Sprague--Dawley(SD)大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)(SHAM)組，去卵巢(OVX)組，杜仲皮提取物組(DZCE)及

6、17β-雌二醇組(E2)。術(shù)后第4周開始灌胃給藥，連續(xù)12周。期間每周觀察一次大鼠體質(zhì)量變化。動物處死前，收集大鼠24h尿液，麻醉動物采集血清。全部動物處死并解剖，采集以下標(biāo)本并進(jìn)行測定分析：觀察大鼠子宮及其它臟器的體質(zhì)量及子宮病理變化，分析藥物對子宮及長期用藥對臟器的影響；采用全自動生化分析儀對大鼠血清和尿液中的Ca、P和ALP等骨代謝指標(biāo)及肝腎功能指標(biāo)進(jìn)行分析；采用ELISA等免疫學(xué)方法對骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)尿DPD和血清OCN進(jìn)行測定；采用

7、三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)對大鼠股骨生物力學(xué)性能進(jìn)行分析；采用DEXA及μCT對股骨的BMD、BMC及干骺端骨小梁微結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行分析。
　　2.50％乙醇加熱回流提取杜仲總木脂素，采用AB-8型大孔樹脂對杜仲總木脂素進(jìn)行分離純化，依次用去離子水、50％乙醇洗脫。收集50％乙醇洗脫部分，濃縮，以松脂醇二葡糖苷作為對照品，采用比色法進(jìn)行分析。
　　3.采用多次酶消化法進(jìn)行大鼠原代成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)，通過相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并用堿性磷酸酶染色

8、和鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色等方法對所獲得的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　4.采用MTT、礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色等方法，觀察杜仲總木脂素對大鼠原代成骨細(xì)胞的增殖、分化及礦化過程的影響。
　　5.采用RT-PCR的方法觀察杜仲總木脂素對大鼠原代成骨細(xì)胞OPG和RANKLmRNA表達(dá)的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.300和500mg/kg/day治療劑量的DZCE連續(xù)治療16周，能夠顯著的改善大鼠股骨的結(jié)構(gòu)力學(xué)參數(shù)，包括骨應(yīng)力和彈性模量。

9、這種生物力學(xué)性能的改變與DZCE增加BMD和改善骨小梁微結(jié)構(gòu)特性密切相關(guān)。DZCE連續(xù)治療16周后能夠劑量依賴性的抑制OVX造成的BMD的下降，同時(shí)也伴隨著反映骨重建的生化指標(biāo)的下降，DZCE顯著降低ALP、OCN和DPD的水平，降低OVX所致的大鼠尿Ca、P的升高。μCT分析結(jié)果顯示500mg/kg/day治療劑量的DZCE顯著的增加BV/TV、Tb.N、Tb.Th以及Conn.D，降低Tb.Sp和SMI指數(shù)。16周的DZCE連續(xù)治療

10、，未觀察到子宮刺激作用，對其它臟器和肝腎功能亦未產(chǎn)生明顯影響。
　　2.分離純化杜仲總木脂素，50％乙醇洗脫液干燥后總固物中杜仲總木脂素純度可達(dá)58.5％。
　　3.多次酶消化法獲得數(shù)量豐富的細(xì)胞，而且具有典型的OB形態(tài)特征，堿性磷酸酶染色和礦化結(jié)節(jié)染色均呈陽性。
　　4.在30～500μg/mL濃度范圍內(nèi)，杜仲總木質(zhì)素劑量依賴性地促進(jìn)大鼠原代成骨細(xì)胞的增殖；100和300μg/mL杜仲總木脂素能夠顯著的增加大鼠原代成

11、骨細(xì)胞ALP的活性和礦化結(jié)節(jié)形成的數(shù)量。
　　5.100和300μg/mL杜仲總木質(zhì)素能夠顯著的調(diào)節(jié)大鼠原代成骨細(xì)胞OPG和RANKL基因表達(dá)，增加兩者mRNA表達(dá)水平的比值達(dá)4倍以上。
　　結(jié)論：
　　1.杜仲治療16周能夠通過增加大鼠股骨的BMD和改善骨小梁微結(jié)構(gòu)特性進(jìn)而阻止OVX導(dǎo)致的股骨生物力學(xué)性能的下降，與雌激素相比較具有無子宮刺激的優(yōu)點(diǎn)。
　　2.杜仲總木脂素能劑量依賴性地促進(jìn)大鼠原代培養(yǎng)成骨細(xì)胞的增

12、殖、分化及成熟。木脂素類化合物可能是杜仲發(fā)揮抗大鼠PMO的活性成分。
　　3.杜仲總木脂素劑量依賴性地提高大鼠原代成骨細(xì)胞OPG/RANKLmRNA表達(dá)水平的比值，表明杜仲總木脂素可能通過調(diào)節(jié)OPG/RANKL表達(dá)對破骨細(xì)胞(osteoclast,OC)分化和成熟產(chǎn)生影響。
　　4.杜仲富含多酚類化合物——木脂素，能夠有效地阻止大鼠PMO的骨量丟失、骨小梁微結(jié)構(gòu)的破壞及生物力學(xué)性能的下降，這種藥理學(xué)作用可能與杜仲活性成分促進(jìn)