不同時間血液灌流對膿毒癥兔促炎細(xì)胞因子及生存時間影響.pdf

1、背景：
　　 膿毒癥(sepsis)是由感染所致的全身炎癥反應(yīng)綜合征,證實有細(xì)菌存在或有高度可疑感灶。膿毒癥-嚴(yán)重膿毒癥-膿毒癥休克-多臟器功能障礙-多臟器功能衰竭-死亡是很多病人的最終轉(zhuǎn)歸。目前,膿毒癥的發(fā)病機(jī)制主要包括:宿主自身免疫性損傷、腸道細(xì)菌移位和腸源性內(nèi)毒素血癥、炎癥系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)失衡、微循環(huán)和線粒體功能障礙綜合征。當(dāng)病原體侵入機(jī)體時,會引起機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)。當(dāng)免疫炎癥反應(yīng)失控時,就會引起細(xì)胞因子風(fēng)暴和炎癥介質(zhì)瀑

2、布而導(dǎo)致膿毒癥。細(xì)菌感染可以用抗生素來治療,但是我們卻無法恢復(fù)腸道的屏障功能。而且抗生素殺死了細(xì)菌,也造成了內(nèi)毒素的大量釋放。在這過程中,內(nèi)毒素中的脂多糖(LPS)與宿主免疫系統(tǒng)作用后所激發(fā)的促炎細(xì)胞因子的分泌,與膿毒癥的嚴(yán)重程度及預(yù)后有密切關(guān)系。在這些促炎的細(xì)胞因子中,最重要的有TNF-α、IL-1、IL-6等。TNF-α:作為始發(fā)的細(xì)胞因子,其核心作用是在炎性反應(yīng)中激活細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng),誘發(fā)IL-1、IL-6、前列腺素等的分泌,由此

3、激發(fā)炎癥連鎖反應(yīng)。TNF-α可引起發(fā)熱,誘導(dǎo)肝細(xì)胞急性期蛋白合成,并直接促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞黏附中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性多型核白細(xì)胞(PMN)進(jìn)入炎癥部位,釋放細(xì)胞因子,參與和放大SIRS,從而在啟動膿毒血癥過程中起主導(dǎo)作用。IL-1:協(xié)同TNF—α啟動膿毒血癥的炎癥反應(yīng),引起發(fā)熱,誘導(dǎo)肝細(xì)胞急性期蛋白合成,刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和TNF,并通過單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-8介導(dǎo)對中性粒細(xì)胞的趨化作用,在膿毒癥發(fā)展過程中起放大作

4、用。IL-6:不僅能激活中性粒細(xì)胞,而且還能延遲吞噬細(xì)胞對衰老和喪失功能的中性粒細(xì)胞的吞噬,從而加劇了炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生；并可導(dǎo)致免疫功能失調(diào)。因此,阻斷和減少上述前炎癥細(xì)胞因子,或能成為有效治療膿毒癥的方法之一。
　　 血液凈化(blood purification)是指把患者血液引出體外并通過一種凈化裝置,除去其中某些致病物質(zhì),凈化血液,達(dá)到治療疾病的目的,這個過程即為血液凈化。血液灌流(hemoperfusion,HP)治療技

5、術(shù)將病人動脈血流經(jīng)管道引向灌流器,血液經(jīng)過灌流器時受到吸附劑或其他生物材料的作用而得到凈化或生化處理,灌流后的血液再經(jīng)管路返回靜脈。HA型樹脂血液灌流器中的吸附劑是由苯乙烯/二乙烯苯聚合而成的大孔高分子聚合物,屬中性大孔樹脂,其通過調(diào)節(jié)反應(yīng)體系溫度、攪拌速度,采用高分子懸浮聚合方法,控制交聯(lián)度和選擇致孔劑調(diào)節(jié)樹脂孔徑到特定的區(qū)間,選擇富含親脂疏水基團(tuán)的交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)使樹脂吸附劑具有親脂疏水性,合理調(diào)節(jié)包膜液體系沸點和干燥溫度調(diào)節(jié)膜孔徑,

6、然后選擇包膜液濃度和干燥速度控制膜厚度制作而成。生物相容性好,其吸附機(jī)理主要是通過中性大孔吸附樹脂作為吸附劑直接吸附清除血液中的相關(guān)致病物質(zhì),利用樹脂分子的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的分子篩作用行物理吸附與疏水基團(tuán)的相互作用。特點是吸附容量大,吸附速度快,機(jī)械強度高,具有相對吸附特異性,能有效清除血中病理性分子,特別是對中大分子及蛋白質(zhì)結(jié)合的病理性分子有相對特異性的吸附能力。目前臨床上已廣泛用于膿毒癥病人的治療。但在膿毒癥何時行血液灌流效果最佳?目前

7、在國內(nèi)外尚無確定的答案。本文設(shè)想通過盲腸結(jié)扎穿孔法造成膿毒癥兔模型,然后根據(jù)盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后時間的不同,分組并分別對兔進(jìn)行單次血液灌流,同時通過多個時間點檢測血清中與膿毒癥密切相關(guān)的促炎細(xì)胞因子TNF—α、IL-1β、IL-6濃度,比較其變化,并結(jié)合與膿毒癥預(yù)后密切相關(guān)的各實驗兔生存時間,以找出膿毒癥兔血液灌流最佳時機(jī),從而為臨床膿毒癥病人血液灌流治療時間的選擇提供一個動物實驗依據(jù),以期改善膿毒癥患者的預(yù)后。
　　 目的:

8、>　　 通過檢測兔血清中促炎細(xì)胞因子TNF—α、IL-1β及IL-6隨血液灌流選擇的時間不同而發(fā)生的濃度變化,結(jié)合生存時間,探討膿毒癥兔行血液灌流最佳時機(jī)。
　　 方法:
　　 1、42只雄性新西蘭大白兔隨機(jī)分成7組,每組6只,每只兔用戊巴比妥鈉靜脈麻醉后,均通過盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)制作膿毒癥模型,并行股動靜脈置管術(shù)以留待血液灌流的需要構(gòu)成血液管路通道。
　　 2、各組分別在CLP術(shù)后3小時、6小時、9小時

9、、12小時、24小時、36小時用自制血液灌流器行單次血液灌流,灌流時間為2小時,速度為5ml/min;空灌流組則在CLP術(shù)后3小時行空灌流(用空灌流器灌流)作為實驗對照。
　　 3、各組兔在CLP手術(shù)前,術(shù)后3小時、6小時、9小時、12小時、24小時、36小時、48小時一共8個時間點抽取外周血標(biāo)本2mL,離心后血清用ELISA法試劑盒集中檢測,板孔反應(yīng)完畢加入終止液后用酶標(biāo)儀在450nm波長測出OD值。利用標(biāo)準(zhǔn)孔OD值通過SPS

10、S軟件求出回歸方程,把各標(biāo)本OD值代入方程,即可得到各血標(biāo)本TNF—α、IL-1β及IL-6濃度。
　　 4、兔固定在手術(shù)臺上至死亡,定時觀察兔精神、呼吸、心率、體溫情況,并每天靜脈補充液體,液體量按80ml/kg,包括0.9％生理鹽水及10％葡萄糖溶液,總張力為1/4,記錄生存時間。
　　 5、統(tǒng)計軟件采用SPSS13.0,IL-6、IL-1β及TNF—α的濃度均用兩因素多水平的重復(fù)測量方差分析,干預(yù)因素為血液灌流(分

11、7組),測量時間因素有8個水平(8個測量點)。并分別對三個指標(biāo)作線性相關(guān)性分析。生存時間用生存分析Kaplan—Meier法,并繪制生存曲線。檢驗水準(zhǔn)定為α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1、觀察指標(biāo)結(jié)果:42只兔CLP術(shù)后約12小時均開始出現(xiàn)體溫升高,精神倦怠、呼吸、心率逐漸增快等癥狀,均于術(shù)后48小時至90小時間死亡。死后解剖兔,腹腔內(nèi)均可見腸管表面及腹膜上有膿性分泌物,膿性或血性腹水,味臭,結(jié)扎部位下顏色黑紫,質(zhì)

12、脆,并與周圍腸管及腹膜粘連。兔生存時間采用生存分析(Kaplan—Meier法),結(jié)果示各灌流組總體差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Chi—Square:57.313,P<0.001)；兩兩比較,12h灌流組生存時間最長(78.667±8.262小時)。
　　 2、檢測指標(biāo)結(jié)果:
　　 (1)TNF—α:重復(fù)測量方差分析球形檢驗:W=0.000,P<0.001,不滿足球形假設(shè),Greenhouse—Geisser校正系數(shù)為:0.26

13、5。主效應(yīng):不同灌流組間總體差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,F值為18.231,P<0.001；重復(fù)測量因素8個不同時間點總體間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,F值為179.566,P<0.001。各灌流組間兩兩比較(LSD法):以術(shù)后3小時灌流組TNF—α平均濃度最低(80.750pg/ml),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；各重復(fù)測量點間兩兩比較:以術(shù)后6小時測量點TNF—α平均濃度最高(937.287 pg/ml),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。交互效應(yīng)及單獨效應(yīng):重復(fù)測量時

14、間與不同灌流組交互水平:F值為5.531,P<0.001,說明重復(fù)測量時間與不同灌流組間有交互作用。當(dāng)空灌流組在術(shù)后6小時的時候,TNF-α平均濃度最高。
　　 (2)IL-1β:重復(fù)測量方差分析:球形檢驗:W=0.000,P<0.001,不滿足球形假設(shè),Greenhouse—Geisser校正系數(shù)為:0.150。主效應(yīng):不同灌流組總體間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,F值8.391,P<0.001;重復(fù)測量因素8個不同時間點總體間差異具有

15、統(tǒng)計學(xué)意義,F值96.566,P<0.001。各灌流組間兩兩比較(LSD法):以術(shù)后6h灌流組IL-1β平均濃度最低(36.160 pg/ml)；各重復(fù)測量點間兩兩比較:以術(shù)后9小時測量點TNF—α平均濃度最高(265.251 pg/ml)。交互效應(yīng)及單獨效應(yīng):重復(fù)測量時間與不同灌流組交互水平:F值4.328,P=0.002,說明重復(fù)測量時間與不同灌流組間有交互作用。當(dāng)24h灌流組在術(shù)后9小時的時候,IL-1β平均濃度最高。
　　

16、 (3)IL-6:重復(fù)測量方差分析:球形檢驗:W=0.000,P<0.001,不滿足球形假設(shè),Greenhouse—Geisser校正系數(shù)為:0.162。主效應(yīng):不同灌流組總體間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,F值2.394,P=0.048；重復(fù)測量因素8個不同時間點總體間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,F值為91.880,P<0.001。各灌流組間兩兩比較(LSD法):以術(shù)后12h灌流組IL-6平均濃度最低(521.957 pg/ml)；各重復(fù)測量點間兩兩

17、比較:以術(shù)后12小時測量點IL-6平均濃度最高(4492.715 pg/ml)。交互效應(yīng):重復(fù)測量時間與不同灌流組交互水平:F值為0.903,P=0.512,說明重復(fù)測量時間與不同灌流組間無交互作用。
　　 結(jié)論:
　　 在膿毒癥早中期(CLP術(shù)后3小時至術(shù)后12小時)血液灌流能最有效地降低膿毒癥兔血TNF-α、IL-1β及IL-6濃度,且在膿毒癥中期行血液灌流(CLP術(shù)后12小時)還能使兔生存時間達(dá)到最長；表明在臨床上