不同來源發(fā)酵食品中乳酸菌的分子分型和原生質(zhì)體制備與再生研究.pdf

1、乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是被世界公認(rèn)的益生菌。從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離鑒定益生乳酸菌并對(duì)分離株進(jìn)行特性的改良，是目前乳酸菌工業(yè)研究的熱點(diǎn)。由于乳酸菌為革蘭氏陽性菌，具有很厚且致密的剛性細(xì)胞壁，受體菌的轉(zhuǎn)化通常采用電轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。然而由于多種因素可能影響轉(zhuǎn)化效果，甚至不能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法雖然操作周期較長，但比較可靠，在正常情況下只要受體菌株能夠形成原生質(zhì)體并在特定培養(yǎng)基中再生出細(xì)胞壁，即可在聚乙二

2、醇(PEG)的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)化。因此原生質(zhì)體的制備與再生是實(shí)現(xiàn)乳酸菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的技術(shù)關(guān)鍵。
　　 本文從市售酸奶、泡菜、臘腸及香腸等發(fā)酵食品為材料。通過MRS平板稀釋法分離的乳酸菌從中分離、篩選到145株乳酸菌。通過運(yùn)動(dòng)性及產(chǎn)氣試驗(yàn)、KOH試驗(yàn)、過氧化氫酶及產(chǎn)酸等生物學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行了初步判斷。
　　 (1)應(yīng)用RS-PCR分型體系將145株乳酸菌擴(kuò)增，經(jīng)過分析歸類劃分為A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、

3、P、Q共17種譜帶模式，其中從活性酸奶中分離得到的44株乳酸菌存在A、B、D共3種不同指紋圖譜，從酸辣泡菜中分離得到的32株乳酸菌存在C、D、E、F、G共5種不同的指紋圖譜；從廣式臘腸中分離到的35株乳酸菌有H、J、O、Q共4種不同的指紋圖譜，從發(fā)酵香腸中分離的34株菌中有H、I、J、K、L、M、N、P、Q共9種指紋圖譜。顯示出發(fā)酵香腸中的乳酸菌株具有良好的多態(tài)性。而不同發(fā)酵食品樣本中存在相同的指紋圖譜，表明主要乳酸菌菌群分布不同的發(fā)酵

4、食品中。
　　 (2)多樣性分析可以看出，shannon信息多樣性指數(shù)，在0.2573-0.5983之間，平均值為0.3930；Nei’s基因多樣性指數(shù)位于0.1327-0.4082之間，Nei’s基因多樣性指數(shù)平均值為0.2365；結(jié)果顯示發(fā)酵食品中乳酸菌的遺傳多樣性。
　　 (3)篩選不同譜型的菌株代表株進(jìn)行16SrDNA鑒定發(fā)現(xiàn)：A型為株嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)；B型、D型為

5、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)；E型、G型、H型、K型、O型、Q型為乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；C型、F型J型、L型、M型和P型為糞腸球菌(Enterococcus faecalis)；I型為格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)?；钚运崮讨兄饕樗峋鸀槭人崛闂U菌(Lactobacillus acidophilus)和干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)。在酸

6、辣泡菜、廣式臘腸和發(fā)酵香腸中存在的主要乳酸菌株為乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和糞腸球菌(Enterococcus faecalis)。乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)在三種發(fā)酵食品中所占的乳酸菌株比分別為59.4％、76.4％、38％；糞腸球菌(Enterococcus faecalis)在三中發(fā)酵食品中所占的乳酸菌株比分別為25％、20.5％、55.9％。
　　 本文同時(shí)研究了菌株YF-2

7、(Lactobacillus casei)和LV108(Lactobacillus rhamnosus)菌體生長狀態(tài)、溶菌酶使用濃度和作用時(shí)間、滲透壓穩(wěn)定劑PH值和再生培養(yǎng)基等因素對(duì)其原生質(zhì)體制備及再生的影響，優(yōu)化了原生質(zhì)體的制備和再生條件。結(jié)果表明：
　　 (1)在制備原生質(zhì)體時(shí)，培養(yǎng)基中加入一定量得甘氨酸可以提高原生質(zhì)體的生成率，研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)菌株YF-2過程中加入1.2％的甘氨酸，可以使原生質(zhì)體的生產(chǎn)率提高將近20％；而對(duì)

8、于菌株LV108，培養(yǎng)基中加入2％的甘氨酸，可以使原生質(zhì)體的生產(chǎn)率提高28％。
　　 (2)不同的菌株對(duì)酶的種類與用量也不同，本研究表明，干酪乳桿菌FY-2較鼠李糖乳桿菌LV108更難獲得原生質(zhì)體，靠單一的溶菌酶酶解不能使YF-2釋放原生質(zhì)體，必需和變?nèi)芫鼗旌鲜褂?，才能得到高產(chǎn)量的原生質(zhì)體。當(dāng)有25ug/mL的變?nèi)芫卮嬖跁r(shí)，原生質(zhì)體制備所用時(shí)間隨溶菌酶濃度的升高而變短，但溶菌酶濃度太高會(huì)很大程度上影響原生質(zhì)體的再生。而對(duì)于鼠

9、李糖乳桿菌LV108，用50mg/mL的溶菌酶，便可高質(zhì)量的制備原生質(zhì)體。
　　 (3)干酪乳桿菌YF-2和鼠李糖乳桿菌LV108原生質(zhì)體制備與再生的最優(yōu)條件為：干酪乳桿菌YF-2以5％的接種量接種至含有1.2％甘氨酸MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期(大約6h)的菌體，用pH值為8.0的LPB重懸，加25mg/mL的溶菌酶和25ug/mL的變?nèi)芫兀?7℃酶解90min，以RM1為再生培養(yǎng)基，原生質(zhì)體再生率可達(dá)33.5％。而鼠李糖乳桿