疣孢漆斑菌原生質(zhì)體制備、再生和誘變育種研究.pdf

1、漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，能催化酚類化合物的氧化，廣泛地應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。為了獲得高產(chǎn)菌株，本文研究了產(chǎn)漆酶疣孢漆斑菌Ws2-6原生質(zhì)體制備與再生的影響因子，在此基礎(chǔ)上用NTG對制備的原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，篩選了高酶活的優(yōu)良菌株，并優(yōu)化了產(chǎn)酶條件。
　　 通過對酶的種類、酶的組合、酶液濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度、滲透壓穩(wěn)定劑等因素的研究獲得了制備疣孢漆斑菌Ws2-6原生質(zhì)體的有效條件。采用0.7 mol/L氯化鈉為滲透壓穩(wěn)定劑，在

2、pH6的磷酸緩沖體系中，以15 mg/ml溶壁酶、5 mg/ml纖維素酶R-10和10 mg/ml蝸牛酶的混合酶液處理培養(yǎng)18h的菌絲體，30℃、80r/min振蕩酶解6小時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)生量達(dá)到最大值7.83×106個(gè)/ml。在單層PDA培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)，Ws2-6原生質(zhì)體形成率達(dá)82％，再生率為8.7％。此外，對原生質(zhì)體釋放的跟蹤觀察發(fā)現(xiàn)，疣孢漆斑菌原生質(zhì)體釋放有頂端、側(cè)端釋放兩種方式。
　　 以NTG為誘變劑處理原生質(zhì)體，

3、采用含致死劑量的愈創(chuàng)木酚選擇性平板篩選了高產(chǎn)漆酶菌株。確定了愈創(chuàng)木酚對Ws2-6的致死濃度為0.2％。NTG對疣孢漆斑菌Ws2-6的原生質(zhì)體進(jìn)行誘變處理，利用平板初篩和搖瓶復(fù)篩，獲得了三株酶活提高的突變菌株N-001、N-003和N-004，產(chǎn)酶活力由原來的750 U/ml提高到1300 U/ml、1825 U/ml和3075 U/ml。突變菌株經(jīng)過5代傳代，酶活穩(wěn)定。
　　 通過單因素實(shí)驗(yàn)分析了影響酶活的因素，獲得了最佳產(chǎn)酶條

4、件。三株突變菌產(chǎn)酶的最適碳源均為葡萄糖，其酶活最高值分別為1325 U/ml、1675 U/ml和2925 U/ml；Ws2-6最適氮源為酵母粉，其酶活最高值分別為1525 U/ml、1950 U/ml和5525 U/ml；檢測了Azure-B、ABTS、堿木素和愈創(chuàng)木酚對突變菌株的誘導(dǎo)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，均能促進(jìn)突變株N-001產(chǎn)酶，其最佳誘導(dǎo)作用的物質(zhì)為Azure-B，酶活可達(dá)1575 U/ml；N-003的最佳誘導(dǎo)作用的物質(zhì)為Azur