洛伐他汀產(chǎn)生菌的原生質(zhì)體融合育種.pdf

1、洛伐他汀（lavostatin）是HMG- CoA（3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶 A）還原酶抑制劑（HMG- CoA -RI）類微生物藥物，它可以有效的降低冠心病和心肌梗塞的發(fā)病率和死亡率。近年來雖然有很多相關(guān)洛伐他?。╨avostatin）基因工程育種研究的報(bào)道，但是由于洛伐他汀生產(chǎn)菌土曲霉和紅曲霉的遺傳背景不清楚，在實(shí)際中都還難以應(yīng)用。而原生質(zhì)體融合技術(shù)有具有重組頻率高、可省去遺傳標(biāo)記、避免基因分離、純化、酶切和拼接操作等優(yōu)點(diǎn)，這

2、對遺傳背景不清楚的土曲霉和紅曲霉的育種來說顯得格外重要。不同代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌的融合子，有可能將它們的部分生物基因整合在一起產(chǎn)生新的雜合代謝產(chǎn)物，達(dá)到與用基因工程方法實(shí)現(xiàn)組合生物合成的相同目的。 洛伐他汀主要用土曲霉（aspergillus terreus）和紅曲霉（monascus rubber）經(jīng)深層發(fā)酵制取，紅曲霉（monascus rubber）不僅產(chǎn)生洛伐他?。ㄒ卜Q莫那可林 K，monacolin K），而且產(chǎn)生據(jù)推測為

3、洛伐他汀生物合成的中間產(chǎn)物的聚酮類物質(zhì)莫那可林 J、L、X，這些物質(zhì)都是HMG-CoA-RI類物質(zhì),具有很強(qiáng)的降低膽固醇、調(diào)節(jié)血脂的功能。而且紅曲霉在我國有著廣泛的應(yīng)用，在釀造紅酒、制腐乳、肉制品著色及制備中藥方面的應(yīng)用已有悠久的歷史，其調(diào)節(jié)血脂的功能在許多國家都得到認(rèn)同。由于其發(fā)酵產(chǎn)品可直接用作食品添加劑，因此有著更廣的應(yīng)用面，并且易被人們接受。同時(shí)土曲霉是現(xiàn)在國內(nèi)生產(chǎn)洛伐他汀的原始出發(fā)菌，它具有優(yōu)良的發(fā)酵性能、較高的洛伐他汀產(chǎn)生能力

4、、成熟的發(fā)酵工藝。本項(xiàng)目將通過土曲霉和紅曲霉原生質(zhì)體融合技術(shù)，將土曲霉生產(chǎn)菌優(yōu)良的發(fā)酵性能、較高的洛伐他汀產(chǎn)生能力、成熟的發(fā)酵工藝和紅曲霉他汀類化合物的結(jié)構(gòu)多樣性、色素產(chǎn)生能力以及長期實(shí)踐證明的安全性結(jié)合起來，選育他汀類化合物和色素高產(chǎn)菌株，以及全新他汀類物質(zhì)的產(chǎn)生菌。在理論上探討用原生質(zhì)體融合技術(shù)實(shí)現(xiàn)組合生物合成的可能性與途徑，為實(shí)際生產(chǎn)選育目的化合物穩(wěn)定、高產(chǎn)菌株。 在本論文中研究考察了各種細(xì)胞裂解酶和滲透壓穩(wěn)定劑等條件對

5、紅曲霉和土曲霉的原生質(zhì)體制備、滅活及融合的影響，同時(shí)采用不同的方法對紅曲霉和土曲霉的DNA進(jìn)行提取純化,探討了提取液中不同的EDTA濃度對DNA提取和RAPD-PCR的影響，同時(shí)采用27條隨機(jī)引物分別對土曲霉、紅曲霉和融合子的DNA進(jìn)行RAPD-PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物用5％的聚丙烯酰胺電泳的進(jìn)行分離，并采用紫外分光光度法對土曲霉、紅曲霉和融合子2的發(fā)酵液進(jìn)行Lovastatin含量測定。結(jié)果表明：土曲霉和紅曲霉在加石英砂混合酶體系中獲得的原生

6、質(zhì)體數(shù)最多，而最適宜的滲透壓穩(wěn)定劑為0.6 mol/L的NaCL。紅曲霉和土曲霉的原生質(zhì)體分別在紫外燈（18 W）下15cm照射50 min和60oC水浴下保持40 min滅活率達(dá)到100％。最適合紅曲霉和土曲霉的原生質(zhì)體融合的條件為20％ PEG在28oC下處理15-20 min。采用氯化芐的方法能提到完整的DNA，20mM的EDTA濃度能得到較好的DNA模板和穩(wěn)定的RAPD-PCR條帶，RAPD-PCR結(jié)果顯示融合子2號在紅曲霉和土