擬南芥光系統(tǒng)Ⅱ中PSB27的晶體結(jié)構(gòu).pdf

1、擬南芥PSB27蛋白位于葉綠體類囊體腔中，PSB27蛋白是由核基因At(1)g03600編碼的，其成熟肽區(qū)蛋白分子量為11.7KD。N端的前導(dǎo)肽序列由67個氨基酸殘基組成，幫助PSB27蛋白進(jìn)入類囊體腔。PSB27對于植物適應(yīng)可變光強(qiáng)是必不可少的，突變體植株在穩(wěn)定持續(xù)強(qiáng)光或弱光處理時，和野生型的擬南芥表型沒有明顯區(qū)別；但在可變光處理下生長異常，突變體植株十分矮小，該突變體是由于psb27基因缺失導(dǎo)致。鑒于psb27突變體特異性地對變化光

2、敏感，推測PSB27蛋白是植物應(yīng)對變化光的關(guān)鍵因子之一。我們猜想，可能是類囊體腔內(nèi)環(huán)境的pH隨著光強(qiáng)的改變而改變，蛋白質(zhì)內(nèi)的酸性或堿性氨基酸可能會感應(yīng)不同的pH;反過來類囊體腔內(nèi)環(huán)境的不同pH也會對PSB27蛋白的結(jié)構(gòu)有影響，因此我們通過X射線衍射出PSB27的晶體結(jié)構(gòu)并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，在晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上通過將擬南芥PSB27同位素15N標(biāo)記的蛋白樣品進(jìn)一步應(yīng)用于異核單量子相干(Heteronuclear single quantum

3、 coherence，HSQC)光譜分析。并通過核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)技術(shù)對處于溶液狀態(tài)中的被15N和13C標(biāo)記的PSB27蛋白的主鏈和側(cè)鏈進(jìn)行指認(rèn)。另外，還通過蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，位于α螺旋之間的酸性和堿性氨基酸殘基在植物體中非常特別，這些氨基酸可能會對外界環(huán)境有很強(qiáng)的感應(yīng)，并改變蛋白結(jié)構(gòu)。所以把它們突變成中性氨基酸并做圓二色譜，分析對結(jié)構(gòu)有何影響。對PSB27蛋白的結(jié)構(gòu)分析將使我們了解

4、植物對光強(qiáng)變化的響應(yīng)機(jī)制，并且對光合作用的研究有重要意義。
　　本研究主要進(jìn)行了三方面的研究，取得如下主要結(jié)果:
　　首先，構(gòu)建pGEX.4T-2-PSB27重組質(zhì)粒，測序正確后用于進(jìn)行PSB27蛋白的表達(dá)及純化，表達(dá)的重組蛋白主要以可溶形式存在，用TEV酶切掉融合蛋白中的GST標(biāo)簽，PSB27蛋白在經(jīng)過分子篩分離、純化后，得到高純度蛋白，濃縮到合適的濃度進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶試驗(yàn)，之后送于上海同步輻射光源(SSRF)BL17U的線

5、站做x射線衍射并收集數(shù)據(jù)。我們確定了擬南芥PSB27的晶體結(jié)構(gòu)，分辨率為1.85(A)。X射線衍射結(jié)果顯示:PSB27有四個α螺旋:H1（殘基3-22）、H2（殘基30-49）、H3(殘基58-77)和H4（殘基85-104），H2和H3之間具有小α螺旋（殘基52Arg-56Gly，指定為H*），類似于藍(lán)藻PSB27的結(jié)構(gòu)。然而，擬南芥PSB27及其藍(lán)細(xì)菌同源物之間存在幾個結(jié)構(gòu)差異，主要位于N-和C-末端的表面電荷。這些差異表明，高等植

6、物和藍(lán)細(xì)菌中的PSB27可以在不同的工作機(jī)制發(fā)揮作用。
　　類囊體是一個酸性環(huán)境pH范圍4.5-7.8，為了測試類囊體腔中的pH變化是否影響擬南芥PSB27的構(gòu)象，設(shè)置了4個pH4.5、5.5、6.7、7.5通過記錄HSQC光譜分析比較他們在不同的pH下PSB27狀態(tài)是否發(fā)生變化，20℃記15N標(biāo)記蛋白的HSQC譜圖時，PH為5.5、6.7、7.5的蛋白信號峰狀態(tài)穩(wěn)定且基本無化學(xué)位移擾動，而蛋白在pH低于5.5的含有20mM PB

7、S，250mM NaCl，2.5mM DTT和2.5mM Na2EDTA的緩沖液中呈現(xiàn)聚集現(xiàn)象，表明擬南芥PSB27在較低pH環(huán)境中的狀態(tài)是不穩(wěn)定的。擬南芥PSB27蛋白質(zhì)樣品在pH6.7下特別穩(wěn)定，可應(yīng)用于處于溶液狀態(tài)中的被15N和13C標(biāo)記的PSB27蛋白的主鏈和側(cè)鏈進(jìn)行指認(rèn)。有研究表明，T.elongatus中PSB27位于PSII表面，并通過交聯(lián)方法檢測PSB27-K91與CP43-K381的相互作用。T.elongatus中P

8、SB27的殘基91K92L93K對應(yīng)于擬南芥PSB27的H4上的86K87R88K殘基。并且T.elongatus中CP43和擬南芥CP43具有81.8％的序列同源性，擬南芥CP43的377LSRLKKDIQPWQERR391類似于T.elongatusCP43中381KNDIQPWQERR391的肽片段，我們合成了擬南芥CP43的377LSRLKKDIQPWQERR391一段氨基酸序列，并使用HSQC滴定方法來測試擬南芥PSB27和C

9、P43的肽片段之間是否有相互作用。然而，擬南芥PSB27的HSQC光譜在加入各種濃度的377LSRLKKDIQPWQERR391的小肽后蛋白信號峰狀態(tài)穩(wěn)定且基本無化學(xué)位移擾動，擬南芥PSB27和CP43的這種小肽之間不存在直接相互作用。本實(shí)驗(yàn)小肽片段太短不足以證明兩者之間有相互作用。
　　最后，構(gòu)建野生型pGEX.4T-3-PSB27重組質(zhì)粒，并以此質(zhì)粒為模板進(jìn)行PSB27點(diǎn)突變載體構(gòu)建，隨后對PSB27突變體進(jìn)行蛋白表達(dá)及純化，