羅哌卡因致幼鼠中樞神經(jīng)毒性驚厥對其突觸可塑性及學習記憶的影響.pdf

1、局麻藥中樞神經(jīng)毒性驚厥系其全身毒性的常見毒副反應(yīng)。由于嬰幼兒特殊的解剖和發(fā)育特點，局麻藥中樞神經(jīng)毒性驚厥在嬰幼兒中更為常見。有研究證實在幼年時期經(jīng)歷長程或反復(fù)驚厥，對其中樞神經(jīng)突觸可塑性及學習記憶有影響。
　　 嬰幼兒或幼年動物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育處于突觸爆發(fā)期，是神經(jīng)細胞快速分化、遷徙、樹突快速形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵時期，此期對各種傷害性刺激抵御能力差，易對其中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理發(fā)育和功能形成產(chǎn)生影響。眾多研究報道其它非局麻藥因素致發(fā)育期反復(fù)

2、或長程驚厥可導致動物成年認知功能和學習記憶能力下降，其機制與離子通道、氨基酸受體、神經(jīng)遞質(zhì)、突觸發(fā)育及學習記憶相關(guān)的蛋白質(zhì)合成、基因表達、信號轉(zhuǎn)導有關(guān)。局麻藥致發(fā)育期嬰幼兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性驚厥，是否會對其神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育造成損害，對其學習記憶能力的形成是否有影響尚無研究定論。
　　 早在上世紀20年代已有關(guān)于局麻藥中樞神經(jīng)毒性的相關(guān)報道。此后麻醉領(lǐng)域?qū)W者們展開了大量關(guān)其機制和防治的研究。局麻藥中樞神經(jīng)毒性以驚厥發(fā)作為主要臨床表現(xiàn)，其

3、機制主要與興奮性—抑制性氨基酸學說、NMDA-Ca2+-NOS通路學說、多巴胺、乙酰膽堿、M型鉀通道等有關(guān)。而以上受體、神經(jīng)遞質(zhì)、及離子通道等均不同程度參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)突觸發(fā)育及學習記憶能力的形成。海馬作為與學習記憶最為相關(guān)的解剖部位，也是局麻藥中樞神經(jīng)毒性驚厥的發(fā)生形成關(guān)鍵部位。
　　 學習記憶是大腦的高級神經(jīng)功能。學習和記憶是兩個相互聯(lián)系和影響的神經(jīng)活動過程，學習是指人或生物依賴經(jīng)驗來改變自身環(huán)境的神經(jīng)活動過程，而記憶則

4、是將通過學習得到的信息儲存和輸出的一種神經(jīng)活動。學習記憶的神經(jīng)基礎(chǔ)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的高度可塑性，包括神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接形態(tài)及與神經(jīng)突觸發(fā)育相關(guān)的各種神經(jīng)遞質(zhì)、蛋白、離子通道、受體等多種不同層次不同階段的可塑性。而其中突觸連接是神經(jīng)可塑性的關(guān)鍵部位，也是實現(xiàn)神經(jīng)元之間傳遞信息、實現(xiàn)生理功能的關(guān)鍵部位。
　　 突觸可塑性是指在外環(huán)境改變時，神經(jīng)元突觸發(fā)生適應(yīng)性改變從而維持其相對穩(wěn)定的狀態(tài)，包括形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上的改變。研究認為在反復(fù)或長程驚厥

5、后，海馬突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)遭到不同程度的破壞，從而影響學習記憶的維持和神經(jīng)功能的發(fā)揮，其破壞程度與學習記憶功能的減退呈正相關(guān)。以往局麻藥中樞神經(jīng)毒性研究發(fā)現(xiàn)，局麻藥抑制突觸軸突生長，并減弱神經(jīng)沖動傳導，從而削弱了突觸維持正常生理功能的能力。突觸素是一種鈣結(jié)合糖蛋白，特異性位于軸突末梢的突觸前膜上。突觸素參與谷氨酸、乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)的釋放過程，與突觸可塑性關(guān)系密切。突觸素作為突觸囊泡的一種特異性標志蛋白，其密度和分布可間接反應(yīng)單位體積內(nèi)突觸數(shù)

6、量和分布情況，與突觸重建及認知過程密切相關(guān)。另一方面突觸素調(diào)節(jié)神經(jīng)元的發(fā)生、發(fā)育及成熟，還可通過調(diào)節(jié)細胞骨架蛋白組裝而影響神經(jīng)元的分化。突觸素在神經(jīng)軸突延伸、突觸連接形成和突觸成熟中具有重要的意義。
　　 鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ(Calcium/calmodulindependentproteinkinaseⅡ，CaMKⅡ)CaMKⅡ是海馬內(nèi)含量最高的一種蛋白質(zhì)，是鈣離子的主要結(jié)合蛋白，且與突觸長時程增強密切相關(guān)，有“學習記

7、憶分子開關(guān)”之稱。環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)單元結(jié)合蛋白(cAMP-responsiveelementbindingprotein，CREB)CREB是一種真核生物細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)導因子，具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的功能，是細胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導通路的關(guān)鍵成分之一。研究發(fā)現(xiàn)CREB在長期記憶的維持中起關(guān)鍵作用。在以往對可卡因急性或反復(fù)應(yīng)用研究中發(fā)現(xiàn)，可卡因通過影響CREB磷酸化，對學習記憶產(chǎn)生影響。Ca2+-CaMKⅡ-CREB通路是中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性和學習記

8、憶能力形成與維持的主要信號通路之一。以往研究發(fā)現(xiàn)，利多卡因、可卡因、普魯卡因抑制海馬長時程增強，與影響鈣調(diào)素有關(guān)。局麻藥中樞神經(jīng)毒性驚厥時引發(fā)鈣超載，嚴重鈣超載與CaMKⅡ、CREB之間影響如何？是否會對突觸可塑性和學習記憶產(chǎn)生影響目前尚不明了。
　　 本課題通過測定0.5％羅哌卡因致幼鼠（P21日齡）中樞神經(jīng)毒性驚厥ED95值，分別制備幼鼠單次驚厥和反復(fù)驚厥實驗?zāi)Ｐ?。?yīng)用Morris水迷宮測定實驗鼠驚厥后近期及成年后學習記憶能

9、力變化;采用透射電鏡觀察中樞神經(jīng)毒性驚厥后實驗鼠在不同時間海馬突觸超微結(jié)構(gòu)變化;以免疫組織化學染色和WesternBlot免疫印跡技術(shù)觀察海馬CA1區(qū)突觸素蛋白的表達;應(yīng)用WesternBlot和熒光實時定量PCR技術(shù)測定CaMKⅡ和p-CREB蛋白和基因表達水平變化。本研究從行為學、形態(tài)學、蛋白和基因水平檢測局麻藥致發(fā)育鼠中樞神經(jīng)毒性驚厥對其突觸可塑性及學習記憶的影響，并探討和研究其可能涉及的機制。
　　 第一章羅:哌卡因致幼

10、鼠中樞神經(jīng)毒性驚厥模型的建立
　　 目的:
　　 采用序貫法(up-downmethod)結(jié)合單位概率回歸法（probit法）測定SD幼鼠（P21日齡）清醒狀態(tài)下，0.5％羅哌卡因腹腔注射致其驚厥ED50及ED95。
　　 方法:
　　 選用健康SpragueDawley(SD)P21日齡幼鼠40只。用生理鹽水配置濃度為0.5％鹽酸羅哌卡因備用。羅哌卡因腹腔注射劑量分為5組，起始劑量為24mg/kg，相鄰

11、劑量間隔等比系數(shù)為0.8。其余劑量組依次為15.4mg/kg、19.2mg/kg、、30mg/kg、37.5mg/kg。
　　 序貫法操作:第一只實驗鼠腹腔注射劑量為24mg/kg，如出現(xiàn)驚厥則下一只實驗鼠腹腔注射劑量下調(diào)至較低相鄰劑量，即19.2mg/kg，如未出現(xiàn)驚厥則下一只實驗鼠腹腔注射劑量上調(diào)至較高相鄰劑量，即30mg/kg，依次類推，直至所有動物均接受一次注射。統(tǒng)計每個劑量組陽性例數(shù)、陰性例數(shù)及總例數(shù)。記錄發(fā)生驚厥實驗

12、鼠驚厥潛伏時間及持續(xù)時間。
　　 實驗鼠行為依照Racine分級法進行分級，0級:無任何反應(yīng)，呈常態(tài)表現(xiàn);Ⅰ級:點頭樣抖動、面部肌肉痙攣表現(xiàn)如節(jié)律性眨眼、咀嚼、胡須抖動等;Ⅱ級:痙攣性表現(xiàn)，點頭或甩尾;Ⅲ級:一側(cè)前肢體陣攣性抖動;Ⅳ級:雙側(cè)前肢體陣攣，但仍可站立;Ⅴ級:全身陣攣性發(fā)作，失去平衡，無法站立，翻正不能。
　　 納入標準:鼠發(fā)生驚厥以Racine分類Ⅴ級（翻正不能、直至全身強直-陣攣性發(fā)作）為標準。驚厥結(jié)束以抽

13、搐停止，恢復(fù)自主行動（翻正恢復(fù)）為標準。統(tǒng)計學處理
　　 采用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差(-x±s)表示。用單位概率回歸法（probit法）測定羅哌卡因腹腔注射ED50及ED95。
　　 結(jié)果:
　　 發(fā)生驚厥實驗鼠表現(xiàn)為自由活動減少，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樵陝?、無目的性奔跑、肢體攣縮倒地、翻正不能、直至全身強直-陣攣性發(fā)作。腹腔注射羅哌卡因后從注射到出現(xiàn)驚厥時間（潛伏期）為4.7±0.9m

14、in，自出現(xiàn)驚厥到驚厥結(jié)束（持續(xù)時間）為26.4±6.0min。經(jīng)probit法計算得出方程式為:y=-17.89+12.75(1g劑量)，得出0.5％羅哌卡因P21日齡SD幼鼠腹腔注射致驚厥劑量ED50為25.12mg/kg(95％可信區(qū)間為22.38-27.54mg/kg)。ED95為33.79mg/kg(95％可信區(qū)間為29.99-48.38mg/kg)。
　　 結(jié)論:
　　 采用序貫法結(jié)合單位概率回歸法（prob

15、it法）測定清醒狀態(tài)下，SD大鼠(P21日齡)腹腔注射0.5％羅哌卡因致驚厥ED50及ED95值分別為25.12mg/kg和33.79mg/kg。
　　 第二章:羅哌卡因致幼鼠中樞神經(jīng)毒性驚厥對其學習記憶的影響
　　 目的:
　　 采用第一章測得的0.5％羅哌卡因致P21日齡SD幼鼠驚厥ED95值，制備中樞神經(jīng)單次和反復(fù)毒性驚厥模型。用Morris水迷宮測定驚厥后實驗鼠的近期和成年期學習記憶能力變化。
　　

16、 方法:
　　 選用21日齡SD幼鼠，采用第一章實驗測得的0.5％羅哌卡因致幼鼠驚厥ED95值（33.8mg/kg）腹腔注射，達到驚厥標準者入選實驗，死亡或未發(fā)生驚厥者剔除實驗，納入實驗鼠30只。
　　 納入標準:同第一章。
　　 實驗分組:單次驚厥組(R，n=10):單次腹腔注射0.5％羅哌卡因33.8mg/kg;反復(fù)驚厥組(FR，n=10):腹腔注射0.5％羅哌卡因33.8mg/kg，1次/d，連續(xù)5d;對

17、照組(C，n=10):腹腔注射注射等量的生理鹽水。各組分別注射后1h～第3d、第5d～第7d、第60日齡(P60)～第62日齡進行行為學測試。
　　 測試內(nèi)容:①定位航行實驗:測試經(jīng)歷3天，每天上、下午各測試1次。實驗鼠由不同落水點面朝桶壁入水，軟件自動記錄大鼠自入水至找到平臺（在平臺停留時間為5s）的圖像，并分析其路徑、游泳速度和所用時間（逃避潛伏期）。如實驗鼠在120s內(nèi)仍未尋找到平臺，則由操作者引導至平臺并停留5s，記錄其

18、潛伏期為120s。②空間探索實驗:最后一次定位航行實驗結(jié)束后（訓練第4d、8d、P62），撤除水池中的平臺。將實驗鼠由3個落水點面壁放入水中，記錄大鼠在120s內(nèi)穿越原平臺所在象限的次數(shù)及在此象限內(nèi)的游泳時間。③觀察尋找平臺潛伏期探索策略。
　　 統(tǒng)計學分析:
　　 采用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差(-x±s)表示。大鼠尋找平臺逃避潛伏期采用重復(fù)測量的方差分析進行統(tǒng)計;同一時點不同組間，組

19、內(nèi)不同時間點間均采用One-WayANOVA方差分析。穿越平臺次數(shù)、在平臺所在象限游泳時均采用One-WayANOVA方差分析;兩兩分析采用LSD法，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:
　　 定位航行實驗尋找平臺潛伏期
　　 第1～3d定位航行實驗尋找平臺潛伏期:經(jīng)重復(fù)測量方差分析，3組間不同時間點尋找平臺潛伏期有顯著差異（F=288.96，P＜0.001）;對照組、單次組及反復(fù)組均隨訓練時間的增加，潛

20、伏期逐漸縮短（F=225.094，P＜0.001;F=152.614，P＜0.001;F=46.603，P＜0.001）;第1天、第2天和第3天3組間訓練潛伏期均有顯著差異（F=7.371，P＜0.005;F=111.73，P＜0.001;F=172.096，P＜0.001）。進一步用LSD兩兩比較分析各組之間的差異:第1、2天潛伏期時間，對照組分別與單次組、反復(fù)組比較組間均有顯著差異(P＜0.05)，單次組和反復(fù)組潛伏期時間明顯長于對

21、照組;而單次組和反復(fù)組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）;第3天潛伏期時間分析，對照組與單次組間潛伏期時間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，對照組、單次組分別與反復(fù)組比較，均有顯著性差異（P＜0.05），反復(fù)組潛伏期時間明顯長于對照組和單次組。
　　 第5～7d定位航行實驗尋找平臺潛伏期:經(jīng)重復(fù)測量方差分析，3組間不同時點尋找平臺潛伏期有顯著差異（F=19.361，P＜0.001）;對照組和單次驚厥組均隨訓練時間增加潛伏期逐漸縮短（F=

22、14.75，P＜0.001;F=17.194，P＜0.001）;反復(fù)驚厥組隨訓練時間延長尋找平臺潛伏期無明顯變化（F=2.777，P＞0.05）;第5、6、7天，3組間尋找平臺潛伏期有顯著差異（F=169.044，P＜0.001;F=235.824，P＜0.001;F=285.290，P＜0.001），進一步用LSD兩兩比較分析各組間的差異:第5、6、7天尋找平臺潛伏期，對照組、單次驚厥組與反復(fù)驚厥組比較，組間均有顯著差異(P＜0.05

23、)，反復(fù)組潛伏期時間明顯長于對照組;而對照組和單次驚厥組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　 P60～P62天定位航行實驗尋找平臺潛伏期:經(jīng)重復(fù)測量方差分析，3組間不同時點尋找平臺潛伏期有顯著差異（F=80.667，P＜0.001）;3組尋找平臺潛伏期均隨訓練天數(shù)增加逐漸縮短（F=16.718，P＜0.001;F=20.580，P＜0.001;F=14.214，P＜0.001）;尋找平臺潛伏期相同時點組間存在顯著差異（F=17

24、7.218，P＜0.005;F=353.348，P＜0.001;F=269.125，P＜0.001），進一步用LSD兩兩比較分析各組之間的差異:在P60～P62天，反復(fù)驚厥組與對照組、單次驚厥組比較均有顯著差異(P＜0.05)，反復(fù)驚厥組潛伏期時間明顯長于對照組;而對照組和單次驚厥組無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　 空間探索實驗
　　 第4天空間探索實驗:①穿越原平臺所在象限次數(shù):3組在第4天穿越原平臺所在象限次數(shù)有

25、顯著差異（F=43.246，P＜0.001）;進一步LSD兩兩比較發(fā)現(xiàn)，反復(fù)驚厥組與對照組、單次驚厥組均有顯著差異(P＜0.05)，反復(fù)驚厥組穿越次數(shù)明顯少于對照組和單次組;而單次驚厥組與對照組無顯著差異(P＞0.05)。②在原平臺所在象限游泳時間:3組在原平臺所在象限的游泳時間有顯著差異（F=129.646，P＜0.001）;進一步LSD兩兩比較發(fā)現(xiàn)，反復(fù)驚厥組與對照組、單次驚厥組均有顯著差異（P＜0.05），反復(fù)驚厥組游泳時間明顯少

26、于對照組和單次組;而單次驚厥組與對照組無顯著差異（P＞0.05）。
　　 第8天空間探索實驗:①穿越原平臺所在象限次數(shù):第8天3組穿越原平臺所在象限次數(shù)有顯著差異(F=57.474，P＜0.001);進一步LSD兩兩比較發(fā)現(xiàn)，反復(fù)驚厥組與對照組、單次驚厥組均有顯著差異(P＜0.05)，反復(fù)驚厥組穿越次數(shù)明顯少于對照組和單次組;而單次驚厥組與對照組無顯著差異（P＞0.05）。②在原平臺所在象限游泳時間:3組在前3天測試結(jié)束后，在原

27、平臺所在象限的游泳時間有顯著差異(F=124.692，P＜0.001);進一步LSD兩兩比較發(fā)現(xiàn)，反復(fù)驚厥組與對照組、單次驚厥組均有顯著差異(P＜0.05)，反復(fù)驚厥組游泳時間明顯少于對照組和單次組;而單次驚厥組與對照組無顯著差異(P＞0.05)。
　　 P62空間探索實驗:①穿越原平臺所在象限次數(shù):3組在P62時間點穿越原平臺所在象限次數(shù)有顯著差異（F=25.327，P＜0.001）;進一步LSD兩兩比較發(fā)現(xiàn)，反復(fù)驚厥組與對照

28、組、單次驚厥組均有顯著差異（P＜0.05），反復(fù)驚厥組穿越次數(shù)明顯少于對照組和單次組;而單次驚厥組與對照組無顯著差異（P＞0.05）。②在原平臺所在象限游泳時間:3組在前3天測試結(jié)束后，在原平臺所在象限的游泳時間有顯著差異（F=120.061，P＜0.001）;進一步LSD兩兩比較發(fā)現(xiàn)，反復(fù)驚厥組與對照組、單次驚厥組均有顯著差異(P＜0.05)，反復(fù)驚厥組游泳時間明顯少于對照組和單次組;而單次驚厥組與對照組無顯著差異（P＞0.05）。平

29、臺潛伏期探索策略
　　 3組大鼠尋找平臺潛伏期探索策略:對照組大鼠多采用直線和趨向式策略;單次組大鼠1～3d多采用邊緣式和趨向式，5～d和P60～62多以直線式和趨向式為主;反復(fù)組多以邊緣式和隨機式為主。
　　 結(jié)論:
　　 1.羅哌卡因致SD幼鼠（P21日齡）單次中樞神經(jīng)毒性驚厥后學習記憶能力有一過性減弱，至驚厥后3天即恢復(fù)至正常水平，對其成年后學習記憶能力無明顯損害。
　　 2.羅哌卡因致SD幼鼠（P

30、21日齡）中樞神經(jīng)反復(fù)毒性驚厥對其近期及成年后學習記憶能力均有影響，表現(xiàn)為學習記憶能力減弱。
　　 第三章:羅哌卡因致幼鼠中樞神經(jīng)毒性驚厥對海馬突觸發(fā)育超微結(jié)構(gòu)的影響
　　 目的:
　　 本章節(jié)通過制備驚厥模型，觀察發(fā)生驚厥SD幼鼠海馬突觸發(fā)育結(jié)構(gòu)變化，以明確羅哌卡因致幼鼠中樞神經(jīng)毒性驚厥對其突觸發(fā)育是否會造成影響，以及與學習記憶能力的改變有何聯(lián)系。
　　 方法:
　　 選用21日齡SD幼鼠，采用

31、第一章實驗得出0.5％羅哌卡因致幼鼠驚厥ED95值(33.8mg/kg)腹腔注射，達到驚厥標準者入選實驗，死亡或未發(fā)生驚厥者剔除實驗，共有實驗鼠36只納入實驗。
　　 納入標準:同第一章。
　　 實驗分組:單次驚厥組(R，n=12):單次腹腔注射0.5％羅哌卡因33.8mg/kg;反復(fù)驚厥組(FR，n=12):腹腔注射0.5％羅哌卡因33.8mg/kg，1次/d，連續(xù)5d;對照組(C，n=12):腹腔注射注入等量生理鹽水

32、。每組根據(jù)處死時間點不同(24h、3d、7d、P60)分為4個亞組(n=3)。
　　 各亞組取大鼠3只，多聚甲醛和戊二醛混合液灌注。灌注結(jié)束后快速于冰上剝出腦組織，取出雙側(cè)海馬組織。按照大鼠腦定位圖譜，在解剖顯微鏡下切取大小約1mm3的海馬CA1區(qū)組織塊，放入2.5％的戊二醛電鏡液中固定。每只實驗鼠選取2張銅網(wǎng)進行觀察測量，觀察內(nèi)容包括神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化。在每張銅網(wǎng)上隨機選取10個結(jié)構(gòu)清楚的突觸，運用電鏡標尺對突觸前后膜間隙和突

33、觸后致密物厚度進行測量。在透射電鏡放大46000倍數(shù)下對突觸數(shù)目進行測量分析。
　　 統(tǒng)計學分析
　　 采用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差(-x±s)表示。突觸后致密物厚度、突觸間隙寬度、突觸數(shù)目均采用One-WayANOVA方差分析;兩兩分析采用LSD法，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:
　　 海馬CA1區(qū)神經(jīng)氈一般形態(tài)變化
　　 對照組各時間點海馬神經(jīng)元形

34、態(tài)規(guī)則完整，結(jié)構(gòu)清楚。細胞結(jié)構(gòu)清晰完整，細胞核呈圓形，染色質(zhì)顆粒分布均勻;胞內(nèi)線粒體豐富，呈圓形或橢圓形，線粒體內(nèi)嵴清晰，規(guī)則排列;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基小體發(fā)達。神經(jīng)氈樹突中線粒體數(shù)目較多，軸突內(nèi)可見神經(jīng)微管。反復(fù)驚厥組在24h、3d、7d時間點神經(jīng)元數(shù)目明顯減少;神經(jīng)元胞漿固縮、濃染，星形膠質(zhì)細胞高度水腫、液化、核固縮。視野內(nèi)可見大量細胞核腫脹，形態(tài)不規(guī)則，核膜腫脹，結(jié)構(gòu)不清晰細胞核內(nèi)染色質(zhì)顆粒分布不均;線粒體出現(xiàn)腫脹，可見空泡、固縮現(xiàn)象。

35、在P60時間點電鏡下海馬神經(jīng)元、線粒體結(jié)構(gòu)形態(tài)基本恢復(fù)正常。單次驚厥組電鏡下觀察，僅在驚厥后24h、3d時間點神經(jīng)元出現(xiàn)水腫，核膜尚完整，細胞核形態(tài)基本正常，少量線粒體出現(xiàn)水腫，偶見線粒體嵴斷裂和空泡現(xiàn)象;在7d、P60時間點基本恢復(fù)正常。
　　 突觸超微結(jié)構(gòu)變化
　　 對照組各時間點突觸數(shù)目豐富，散在。突觸結(jié)構(gòu)清晰，突觸前膜、突觸間隙及突觸后膜致密物清晰可見。在突觸前膜靠近突觸間隙一側(cè)可見較多形態(tài)規(guī)則、大小均勻的突觸小

36、泡。突觸間隙清晰可見，突觸后致密結(jié)構(gòu)較厚，散在均勻致密顆粒。反復(fù)驚厥組，除P60時間點外，其余各時間點突觸數(shù)目均較對照組顯著減少，尤其在3d、7d時間點。突觸結(jié)構(gòu)模糊不清，突觸間隙明顯增寬，突觸小泡散在，形態(tài)大小不均，突觸后致密物變薄。單次驚厥組在24h、3d時間點，突觸數(shù)目稍減少，突觸結(jié)構(gòu)尚清晰，間隙稍增寬，突觸后致密物厚度無明顯變化。在7d和P60時間點，突觸結(jié)構(gòu)基本正常。海馬CA1區(qū)突觸數(shù)、突觸間隙和突觸后致密物厚度比較
　

37、　 單次驚厥早期(24h、3d)，突觸數(shù)目較對照組減少，突觸間隙較對照組增寬（P＜0.05），在驚厥后7d及實驗鼠成年期(P60)和對照組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）;單次驚厥組突觸后致密物在驚厥后24h時間點與對照組比較明顯變薄，其余時間點與對照組比較無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;反復(fù)驚厥組在驚厥后24h、3d、7d時間點，突觸數(shù)目較對照組和單次驚厥組均明顯減少，突觸間隙明顯增寬，突觸后致密物明顯變?。≒＜0.05），成年期(P

38、60)與對照組及單次組比較三者均無統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 羅哌卡因致SD幼鼠（P21日齡）中樞神經(jīng)毒性驚厥影響海馬CA1區(qū)突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為線粒體破壞，突觸數(shù)目減少，突觸間隙增寬，突觸后致密物變薄。單次及反復(fù)驚厥對其成年后海馬突觸發(fā)育無明顯影響。
　　 第四章:羅哌卡因致幼鼠中樞神經(jīng)毒性驚厥對海馬突觸素表達的影響
　　 目的:
　　 本章節(jié)內(nèi)容采用免疫組化及Wester

39、nBlot方法檢測驚厥大鼠海馬不同時點突觸素表達，觀測局麻藥致大鼠驚厥是否影響其表達，以及與突觸發(fā)育及學習記憶的聯(lián)系。
　　 方法:
　　 選用21日齡SD幼鼠，采用第一章實驗得出的0.5％羅哌卡因致幼鼠驚厥ED95值(33.8mg/kg)腹腔注射，達到驚厥標準者入選實驗，死亡或未發(fā)生驚厥者予以剔除，共選用實驗鼠108只。
　　 納入標準:同第一章。
　　 實驗分組:單次驚厥組(R，n=36):單次腹腔注

40、射0.5％羅哌卡因33.8mg/kg;反復(fù)驚厥組(FR，n=36):腹腔注射0.5％羅哌卡因33.8mg/kg，1次/d，連續(xù)5d;對照組(C，n=36):腹腔注射注射等量生理鹽水。每組根據(jù)處死時間點不同(24h、3d、7d、P60)分為4個亞組(n=9)。
　　 各亞組取6只大鼠制備免疫組織化標本，灌注后迅速取腦切成薄片置入多聚甲醛固定。進入腦片包埋、切片、染色過程。在光學顯微鏡下觀察切片并拍片，每只動物取6張切片，用IPP圖

41、像處理軟件，測量海馬CA1區(qū)免疫反應(yīng)產(chǎn)物的光密度值。另外每組各時間點再各取3只，給予3％水合氯醛腹腔注射麻醉。迅速斷頭于冰上取腦，分離出雙側(cè)海馬組織，用WesternBlot免疫印跡法測定大鼠海馬突觸素蛋白含量。掃描X膠片，采用Quantityone圖像分析軟件分析目標條帶的吸光度值，以β-actin條帶吸光度值為參照，兩者比值為突觸素蛋白的表達水平。
　　 統(tǒng)計學分析
　　 采用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計

42、量資料以均數(shù)±標準差(-x±s)表示。不同時間點間各組突觸素表達采用One-WayANOVA方差分析;兩兩分析采用LSD法，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:
　　 海馬CA1區(qū)突觸素表達
　　 單次驚厥組與對照組相比，海馬CA1區(qū)突觸素蛋白水平表達僅在驚厥后24h時間點低于對照組(P＜0.05)，其余各時間點均無顯著差異;反復(fù)驚厥組與對照組比較，海馬CA1區(qū)突觸素蛋白表達除P60時間點無統(tǒng)計學差異外，其

43、余各時間點均顯著低于對照組(P＜0.05);反復(fù)驚厥組與單次驚厥組比較，鼠海馬CA1區(qū)突觸素表達水平除P60時間點無統(tǒng)計學差異外，其余時間點均顯著低于單次驚厥組（P＜0.05）。
　　 WesternBlot檢測大鼠海馬突觸素表達
　　 單次驚厥組與對照組相比，海馬突觸素蛋白水平表達僅在驚厥后24h時間點顯著低于對照組(P＜0.05)，其余各時間點均無顯著差異;反復(fù)驚厥組與對照組比較，海馬突觸素蛋白表達除P60時間點無統(tǒng)

44、計學差異外，其余各時間點均顯著低于對照組（P＜0.05）;反復(fù)驚厥組與單次驚厥組比較，鼠海馬CA1區(qū)突觸素表達水平除P60時間點無統(tǒng)計學差異外，其余時間點均顯著低于單次驚厥組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.羅哌卡因致SD幼鼠（P21日齡）單次驚厥對海馬突觸素表達有一過性影響，在驚厥后第3天基本恢復(fù)至正常，對成年期海馬突觸素表達無影響。
　　 2.SD幼鼠（P21日齡）經(jīng)歷反復(fù)驚厥后，海馬突觸素表達減少

45、至驚厥后第7天，對其成年后表達無影響。
　　 第五章:羅哌卡因致幼鼠中樞神經(jīng)毒性驚厥對海馬CaMKⅡ和p-CREB和表達的影響
　　 目的:
　　 本章通過制備羅哌卡因驚厥模型，運用WesternBlot和QT-PCR技術(shù)對海馬CaMKⅡ和p-CREB蛋白和基因表達水平進行檢測，觀察CaMKⅡ和p-CREB在局麻藥毒性驚厥對突觸發(fā)育及學習記憶的影響。
　　 方法:
　　 選選用21日齡SD幼鼠，采

46、用第一章實驗得出的0.5％羅哌卡因致幼鼠驚厥ED95值（33.8mg/kg）腹腔注射，達到驚厥標準者入選實驗，死亡或未發(fā)生驚厥者剔除實驗，共選用實驗鼠120只。
　　 納入標準:同第一章。
　　 實驗分組:單次驚厥組(R，n=40):單次腹腔注射0.5％羅哌卡因33.8mg/kg;反復(fù)驚厥組(FR，n=40):腹腔注射0.5％羅哌卡因33.8mg/kg，1次/d，連續(xù)5d:對照組(C，n=40):腹腔注射注射等量生理鹽水

47、。每組根據(jù)處死時點不同(24h、3d、7d、P60)分為4個亞組(n=10)。
　　 合成CaMKⅡ和CREB上下游引物。每亞組取5只大鼠提取總RNA、逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴增，反應(yīng)條件為:93℃3min，然后93℃45s，55℃1min，共循環(huán)40次，對整個升溫過程進行全程熒光信號收集，繪制融解曲線并分析。定量的方法以2-△△Ct（Ct代表循環(huán)閾值）來表達基因的表達量，計算公式為△△Ct=[Ct（待測組目標基因）—Ct（內(nèi)參）]—[

48、Ct（對照組目標基因）—Ct（內(nèi)參）]。
　　 另外每組各時間點再各取5只，給予3％水合氯醛腹腔注射麻醉。迅速斷頭于冰上取腦，分離出雙側(cè)海馬組織，用WesternBlot免疫印跡法測定大鼠海馬CaMKⅡ和p-CREB含量。掃描X膠片，采用Quantityone圖像分析軟件分析目標條帶的吸光度值，以β-actin條帶吸光度值為參照，兩者比值為蛋白的表達水平。
　　 統(tǒng)計學分析
　　 采用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)

49、統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差(-x±s)表示。各時間點不同組間CaMKⅡ和p-CREB蛋白和基因表達水平比較采用One-WayANOVA;兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:
　　 CaMKⅡ在各組的表達情況
　　 24h和3d時間點單次驚厥組CaMKⅡ基因表達明顯低于對照組（P＜0.05），其余時間點無明顯差異。24h、3d、7d及P60時點反復(fù)驚厥組CaMKⅡ的表達均明顯低于對

50、照組（P＜0.05）;24h、3d、7d及P60時點反復(fù)驚厥組CaMKⅡ的表達均明顯低于單次驚厥組（P＜0.05）。
　　 CREB在各組的表達情況
　　 單次驚厥組p-CREB在24h、3d、7d及P60時間點的表達與對照組相比均無明顯差異（P＞0.05）;反復(fù)驚厥組CREB在24h、3d、7d及P60時點的表達均明顯低于對照組和單次驚厥組(P＜0.05)
　　 結(jié)論:
　　 1.羅哌卡因致SD幼鼠(P

51、21日齡)毒性單次驚厥后海馬CaMKⅡ在驚厥后24h、3d表達明顯降低。羅哌卡因致幼鼠反復(fù)驚厥在驚厥早期及成年后CaMKⅡ表達均明顯減少。
　　 2.羅哌卡因致SD幼鼠（P21日齡）單次毒性驚厥對海馬p-CREB的表達無影響，羅哌卡因致幼鼠反復(fù)毒性驚厥海馬p-CREB的表達在驚厥早期和成年均明顯減少。
　　 全文結(jié)論:
　　 1.羅哌卡因致幼鼠（P21日齡）中樞神經(jīng)毒性驚厥影響其突觸可塑性:單次及反復(fù)驚厥大鼠均表

52、現(xiàn)為海馬CA1區(qū)突觸數(shù)目減少、突觸間隙增寬、突觸后致密物變薄，反復(fù)驚厥比單次驚厥所致?lián)p害程度更為嚴重，且持續(xù)時間延長。
　　 2.羅哌卡因致幼鼠（P21日齡）中樞神經(jīng)毒性驚厥影響其學習記憶能力:單次驚厥大鼠表現(xiàn)為—過性的學習能力障礙，而反復(fù)驚厥大鼠學習記憶能力障礙持續(xù)至成年后。
　　 3.羅哌卡因致幼鼠（P21日齡）中樞神經(jīng)毒性驚厥對其學習記憶的影響可能與突觸可塑性破壞、海馬突觸素表達下調(diào)、CamkⅡ及p-CREB表達下