一氧化氮合酶-一氧化氮途徑對降鈣素基因相關(guān)肽合成與釋放的影響.pdf

1、第一章高血壓大鼠一氧化氮合酶抑制物濃度與CGRP表達的變化 背景:高血壓作為一種常見的心血管疾病，對人類健康影響極大，有效的降壓可顯著降低患者的死亡率。在高血壓疾病的進程中，常伴隨著血壓調(diào)節(jié)的生理因素的異常，包括交感和感覺神經(jīng)系統(tǒng)活性改變，血管活性物質(zhì)(如一氧化氮)水平的異常等。 一氧化氮(NO)是一種內(nèi)源性的血管舒張因子， NO合成與代謝受多種因素調(diào)節(jié)，臨床研究發(fā)現(xiàn)，高血壓患者血中NO濃度降低，可能與高血壓患者體內(nèi)一氧

2、化氮合酶抑制物水平增加有關(guān)。非對稱二甲基精氨酸(ADMA)是一種內(nèi)源性的一氧化氮合酶(NOS)抑制物，是一種新發(fā)現(xiàn)的心血管疾病危險因子。 降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是一種感覺神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛分布于心血管組織。外周循環(huán)中的CGRP主要由背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的神經(jīng)元細胞合成并釋放。研究發(fā)現(xiàn)，高血壓患者血漿中CGRP的濃度顯著降低，CGRP可能在高血壓疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。 CGRP的釋放可受多種內(nèi)源性活性物質(zhì)包括N

3、O的調(diào)節(jié)。基于ADMA競爭性抑制NOS，降低NO水平，推測高血壓動物CGRP濃度的降低可能與ADMA升高有關(guān)。因此，本實驗在自發(fā)性高血壓大鼠和體外培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元細胞上研究了ADMA與CGRP的相互作用。 方法: 實驗一：自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)ADMA與CGRP的關(guān)系實驗分為3組：①WKY對照組；②SHR組；③SHR+L-精氨酸組(SHR大鼠給予L-精氨酸1g/kg/day處理14天)。處理結(jié)束時，測定大鼠血壓(尾

4、動脈袖套法測收縮壓)，取血漿測ADMA(高效液相色譜法)，CGRP(放射免疫法)及NO(硝酸還原酶法)的含量，并取背根神經(jīng)節(jié)測CGRP含量及以RT-PCR分析CGRP mRNA表達水平。 實驗二：培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細胞ADMA對CGRP合成與釋放的影響取出生3天內(nèi)的大鼠背根神經(jīng)節(jié)，體外培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細胞，實驗分組：①對照組；②低中高濃度ADMA處理組；③高濃度ADMA+L-精氨酸組；④L-精氨酸對照組。測定培養(yǎng)上清液中

5、CGRP及NO濃度，并分析神經(jīng)元細胞CGRP mRNA表達水平。 結(jié)果: 動物實驗結(jié)果顯示，SHR組大鼠血壓顯著高于WKY組，給予L-精氨酸處理可降低血壓； SHR組血漿ADMA含量高于WKY組，CGRP和NO含量低于WKY組，且SHR組背根神經(jīng)節(jié)中CGRP的含量及CGRP mRNA(包括CGRP-α及β)表達水平亦顯著低于WKY組；給予L-精氨酸處理可升高SHR組體內(nèi)No和CGRP的含量及上調(diào)CGRP的表達，但對ADM

6、A無明顯影響。 在培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細胞，ADMA可顯著抑制CGRP的合成與釋放，并減少NO的生成，其作用可為L-精氨酸逆轉(zhuǎn)。 結(jié)論:高血壓大鼠CGRP表達與釋放降低可能與ADMA升高降低NO水平相關(guān)。 第二章辣椒素受體對CGRP表達的調(diào)節(jié)及機制 背景:降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是辣椒素敏感的感覺神經(jīng)的主要遞質(zhì)，由37個氨基酸殘基組成，背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元是合成CGRP的主要部位。CGRP的合成與釋放受

7、多種因素的調(diào)節(jié)，包括NGF、NO、某些炎癥因子、辣椒素等，其中分布于感覺神經(jīng)的胞體或末梢膜上的辣椒素受體(VR<,1>)是調(diào)節(jié)CGRP釋放的關(guān)鍵受體。VR<,1>可被多種刺激因素激活，如芳香草酸化合物、高溫和氫離子等。花生四烯酸乙醇胺(ANA)是體內(nèi)存在VR1的內(nèi)源性配體，辣椒素及中藥吳茱萸的有效成分吳茱萸次堿也可激活辣椒素受體。激活VR<,1>引起二價陽離子(主要是鈣離子)內(nèi)流，可導(dǎo)致CGRP的釋放。 一氧化氮(NO)作為一種

8、重要的氣體分子，經(jīng)一氧化氮合酶(NOS)催化合成。NOS包括三種亞型：nNOS，iNOS和eNOS。其中神經(jīng)元細胞中NO主要由nNOS合成，免疫組化分析發(fā)現(xiàn)nNOS、CGRP與VR1呈現(xiàn)一種共分布，且已有研究顯示抑制NO的生成可顯著降低辣椒素引起的CGRP釋放。 本研究擬在體外培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細胞，觀察VR1受體對于CGRP合成與釋放的調(diào)節(jié)，并分析NO是否參與這一過程。 方法: 實驗一： VR1對CGRP合

9、成與釋放的影響培養(yǎng)新生大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細胞，給予不同劑量辣椒素(10<'-8>，10<'-7>，10<'-6>M)、ANA(10<'-8>，10<'-7>，10<'-6>M)、吳茱萸次堿(10<'-7>，10<'-6>，10<'-5>M)處理，以放射免疫法檢測細胞培養(yǎng)上清液中CGRP的含量，并通過RT-PCR分析CGRP mRNA水平。 實驗二：辣椒素促CGRP合成與釋放的機制培養(yǎng)新生大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細胞，實驗分組：①對

10、照組；②辣椒素(10<'-6> M)處理組；③辣椒素+EGTA組；④辣椒素+L-NAME組；⑤EGTA組；⑥L-NAME組。檢測培養(yǎng)上清液中CGRP(放射免疫法)及NO(硝酸還原酶法)的含量，通過RT-PCR分析CGRP及nNOS mRNA的表達水平，并以Western-blot分析nNOS在神經(jīng)元內(nèi)的蛋白表達水平。 結(jié)果: 在培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細胞，辣椒素，花生四烯酸乙醇胺及吳茱萸次堿均可濃度依賴性上調(diào)DRG神經(jīng)元

11、細胞CGRP mRNA表達水平和升高培養(yǎng)液中CGRP的含量，其效應(yīng)可被高濃度的辣椒辣素預(yù)處理所抑制。Ca<'2+>鰲合劑EGTA與NOS抑制劑L-NAME可抑制辣椒素的促CGRP合成與釋放效應(yīng)。辣椒素可增加細胞培養(yǎng)液中NO含量，其作用可為EGTA和L-NAME抑制。RT-PCR及Western-blot分析顯示，辣椒素可濃度依賴性的增加神經(jīng)元細胞中nNOS mRNA和蛋白水平的表達，其作用亦可被EGTA所阻斷。 結(jié)論:激動辣椒素

12、受體VR1可促進背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細胞中CGRP的合成與釋放，辣椒素介導(dǎo)的CGRP合成與釋放涉及NO途徑。 第三章 NO調(diào)節(jié)CGRP表達涉及ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 背景:降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)為37個氨基酸的神經(jīng)多肽，具有廣泛的生物學(xué)作用，不僅在維持循環(huán)穩(wěn)定起重要作用，還參與傷害性信息的傳遞和痛覺過敏。背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元細胞是循環(huán)系統(tǒng)中CGRP的主要來源。CGRP的合成與釋放受多種活性物質(zhì)(包括NO)的調(diào)節(jié)。 一

13、氧化氮(NO)是機體重要的生物信使分子和神經(jīng)調(diào)質(zhì)。在神經(jīng)系統(tǒng)，NO可參與多種生理功能和病理生理過程，包括對神經(jīng)源性CGRP釋放的調(diào)節(jié)。在第一部分實驗也證明，SHR大鼠血中CGRP濃度降低可能與ADMA升高，減少NO生成有關(guān)。此外，在第二部分結(jié)果及其他研究者的研究中也證明辣椒素所誘導(dǎo)的CGRP合成與釋放涉及NO途徑。然而，NO對CGRP合成與釋放的調(diào)節(jié)機制尚未明了。 已知NO可通過cGMP依賴性和非依賴性的機制參與細胞體內(nèi)多種生物

14、學(xué)過程。在神經(jīng)元細胞中，NO能活化絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)。研究報道，促CGRP合成的神經(jīng)生長因子(NGF)或嗎啡均可活化神經(jīng)元細胞中MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而阻斷ERK的活化可顯著抑制CGRP的生成。這提示NO促進CGRP合成與釋放可能涉及ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 本實驗在培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細胞中，觀察了NO供體SNP及NOC-18對于細胞CGRP表達和釋放的影響，并分析ERK信號傳導(dǎo)通路在這一過程中的作用。 方法

15、 實驗一：NO對CGRP合成與釋放的影響培養(yǎng)新生大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細胞，給予不同劑量NO供體SNP(0.1，1，10 μmol/L)、NOC-18(0.1，1，10μmol/L)，以放射免疫法檢測細胞培養(yǎng)上清液中CGRP(放射免疫法)的含量，并通過RT-PCR分析CGRP mRNA水平。 實驗二：ERK活化對NO促CGRP合成與釋放的影響培養(yǎng)新生大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細胞，實驗分組：①對照組；②不同濃度一氧化氮供體NOC

16、-18(0.1，1，10μmol/L)處理組；③NOC-18(10μmol/L)+U0126(10 μmol/L)組；④U0126組。檢測培養(yǎng)上清液中CGRP(放射免疫法)的含量， RT-PCR分析神經(jīng)元內(nèi)CGRP mRNA的表達水平，并以Western-blot分析phospho-ERK蛋白表達水平。 結(jié)果: SNP和NOC-18可濃度依賴性促進DRG神經(jīng)元細胞中CGRP合成與釋放，ERK抑制劑U0126可抑制NOC-