羊水來源OCT-4陽性胎兒干細胞的分離和培養(yǎng)及其生物學特性研究.pdf

1、目的：OCT-4是控制干細胞分化、決定干細胞全能性的關(guān)鍵物質(zhì)。在發(fā)現(xiàn)羊水中存在OCT-4陽性干細胞的基礎(chǔ)上，本研究擬以SSEA-4和CD44交叉結(jié)合分離的方法，從羊水細胞中分離OCT-4陽性的全能干細胞，鑒定其生物學性狀和分化潛能，并建立穩(wěn)定的細胞系。本研究有望為獲得人類的、能向內(nèi)、中、外三個胚層組織細胞定向分化的全能干細胞提供一種安全、簡便的方法，為組織工程開辟新的種子細胞來源。 方法：在知情同意的條件下，通過羊膜腔穿刺獲取人

2、孕16～22周羊水50ml，利用SSEA-4和CD44交叉結(jié)合分離的方法，通過免疫磁珠的微磁場分離作用，從羊水中分離出SSEA-4+CD44- 、SSEA-4+CD44+、 SSEA-4-CD44- 和SSEA-4-CD44+細胞，培養(yǎng)擴增，免疫熒光染色鑒定OCT-4陽性率，選擇最佳的分選組合，觀察其生物學特性：細胞生長周期，生長曲線，構(gòu)建類胚體，分析細胞性質(zhì)：檢測NANOG、AKP、Myosin、Vimentin、Desmin、Nes

3、tin、MAP-2、FN、Sox-2、Runx-1和Rex-1等細胞因子的表達情況。取第三代OCT-4陽性細胞，使其向肝細胞誘導分化，通過形態(tài)學觀察，免疫組化，RT-PCR和Western-Blot檢測白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(α-AFP)、CK18和CK19的表達，評價誘導效果。將生長旺盛的第三代OCT-4陽性干細胞種植于裸鼠背部皮下，通過HE切片和三個胚層特異性染色對羊水干細胞的成瘤性進行研究和分析。 結(jié)果： 1.

4、原代羊水細胞在體外培養(yǎng)體系中增殖迅速，形成上皮細胞樣克隆和長梭形細胞樣克隆，流式細胞儀和免疫熒光染色顯示部分細胞表達CD44和SSEA-4。 2.通過免疫磁珠細胞分選法，利用SSEA-4和CD44交叉結(jié)合分離原理，可從原代羊水細胞中分離得到SSEA-4+CD44- 、SSEA-4+CD44+、 SSEA-4-CD44- 和SSEA-4-CD44+細胞，OCT-4免疫熒光染色結(jié)果顯示：SSEA-4+CD44-組細胞和SSEA-4+

5、CD44+組細胞OCT-4陽性率最高，分別達90％和91％，而SSEA-4-CD44- 組細胞和SSEA-4-CD44+組細胞均未檢測到OCT-4表達，對SSEA-4+CD44+ 和SSEA-4+CD44-細胞進行后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，該兩組細胞均表達NANOG、Vimentin、Desmin、Nestin、MAP-2、FN、Sox-2、Runx-1和Rex-1等細胞因子，明確SSEA-4是分離OCT-4陽性干細胞必須標志，SSEA-4陽性細胞

6、的純化可以顯著提高OCT-4陽性率，而間充質(zhì)干細胞表面標志CD44和OCT-4陽性率無明顯關(guān)聯(lián)。 3.OCT-4陽性干細胞經(jīng)20ng/ml HGF和10ng/ml bFGF誘導14天后呈典型的多角形和短梭形肝細胞樣細胞，表達ALB、 CK18和CK19。 4.OCT-4陽性胎兒干細胞植入裸鼠背部皮下2周，有瘤樣新生物形成，HE染色見瘤內(nèi)結(jié)構(gòu)紊亂，細胞成分復雜，內(nèi)胚層染色(HNF-3β)、中胚層染色(Desmin、Vime