北京油雞胚胎肝臟來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究.pdf

1、干細(xì)胞研究是生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，很多研究成果已應(yīng)用于臨床實(shí)踐中。本研究以中國(guó)特有的地方優(yōu)良家禽品種北京油雞為研究對(duì)象，對(duì)7d雞胚胎肝組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）進(jìn)行體外分離培養(yǎng)，在優(yōu)化的體外培養(yǎng)環(huán)境中細(xì)胞傳至25代，凍存156支細(xì)胞，應(yīng)用免疫熒光和RT-PCR技術(shù)分別對(duì)分離傳代細(xì)胞進(jìn)行鑒定，并對(duì)傳代細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇進(jìn)行探討是否可以通過(guò)干細(xì)胞凍存保存北京油雞這一珍貴遺傳資源；對(duì)分離鑒定的MSCs通過(guò)不同的培養(yǎng)條件進(jìn)行誘導(dǎo)，分別

2、向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)元和心肌細(xì)胞進(jìn)行分化，應(yīng)用免疫熒光和RT-PCR對(duì)誘導(dǎo)分化細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果表明：
　　（1）體外環(huán)境下能夠分離培養(yǎng)北京油雞胎肝來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，分離細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次傳代培養(yǎng)后仍然具有干細(xì)胞所特有的增殖和分化潛能，細(xì)胞的各項(xiàng)特性符合間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。
　　（2）在優(yōu)化組（含10%FBS、5 ng/mL bFGF DMEM/F12培養(yǎng)基）的培養(yǎng)體系下，雞胎肝MSCs體外培養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛，呈現(xiàn)典

3、型的成纖維細(xì)胞形態(tài)，絕大多數(shù)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭狀或三角形或不規(guī)則形，細(xì)胞排列成漩渦狀或火焰狀，隨著體外培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞形態(tài)趨向均一，且低代次細(xì)胞增殖較快，高代次細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減慢，隨傳代次數(shù)增多老化細(xì)胞增加。
　?。?）免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示不同代次雞胎肝MSCs的表面標(biāo)志CD29和CD44均成陽(yáng)性表達(dá)，而CK19和CD34均不表達(dá)。RNA轉(zhuǎn)錄水平RT-PCR檢測(cè)鑒定各代次MSCs表面標(biāo)志CD44、CD29、CD71和C

4、D73均成陽(yáng)性表達(dá)，且灰度分析顯示除了CD73的表達(dá)量隨細(xì)胞代次的增加而減弱外，其他標(biāo)志物的表達(dá)量差別不顯著。分離培養(yǎng)得到的細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞，MSCs在體外傳代培養(yǎng)后仍能維持MSCs的特性。
　?。?）雞胎肝MSCs隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇活率呈下降趨勢(shì)，不同代次雞胎肝MSCs的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈經(jīng)典的“S”型，細(xì)胞倍增均歷經(jīng)潛伏期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期以及生長(zhǎng)停滯期。培養(yǎng)的低代次雞胎肝MSCs中所含S期細(xì)胞較高，G0/G1期細(xì)胞

5、較低，隨細(xì)胞傳代次數(shù)的升高 G0/G1期比例隨之增高，S期細(xì)胞顯著下降。冷凍復(fù)蘇細(xì)胞培養(yǎng)符合體外細(xì)胞培養(yǎng)的生長(zhǎng)規(guī)律。
　　（5）雞胎肝MSCs在一定的培養(yǎng)條件下不同代次的細(xì)胞均能夠分別向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)元和心肌細(xì)胞進(jìn)行分化，且分化后的細(xì)胞在形態(tài)上發(fā)生了相應(yīng)的變化，少部分細(xì)胞出現(xiàn)死亡；隨著細(xì)胞代次的增高細(xì)胞的分化能力減弱，高代次分化后的細(xì)胞老化明顯；實(shí)驗(yàn)分別通過(guò)相對(duì)應(yīng)染色方法對(duì)分化后細(xì)胞進(jìn)行了物理檢測(cè)檢驗(yàn)分化效果，并通過(guò) R

6、T-PCR進(jìn)一步檢測(cè)了 PPAR-γ、LPL，Collage typeⅠ、Osteopontin， Nestin、NF和 Desmin、MyoD1這四種細(xì)胞各兩種標(biāo)志物，并分析了分化的目的細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)量變化規(guī)律，證明高代次的細(xì)胞相較于低代次的細(xì)胞分化細(xì)胞標(biāo)志物均出現(xiàn)表達(dá)量下調(diào)的趨勢(shì)，說(shuō)明低代次的細(xì)胞在體外更易被誘導(dǎo)分化，細(xì)胞隨傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞的分化能力在減弱。實(shí)驗(yàn)證明由7d雞胚胎肝所分離的MSCs為多潛能間充質(zhì)干類型的干細(xì)胞。<