胰腺癌干細胞Oct4、Nanog基因生物學特性的研究.pdf

1、目的：
　　研究胚胎干性相關基因Oct4和Nanog在人胰腺癌腫瘤干細胞(PCSCs)和普通腫瘤細胞中表達情況,然后再通過特異shRNA沉默PCSCs細胞中Oct4和Nanog的表達,研究PCSCs干性特征的變化及其機制。
　　方法：
　　本實驗分為兩大部分。
　　第一部分:用流式細胞儀在人胰腺癌Panc-1細胞系中以CD44+CD24+ESA+為表面標記篩選PCSCs,RT-PCR法和細胞免疫熒光法檢測PCSC

2、s細胞和Panc-1細胞中Oct4和Nanog基因的表達情況。用CCK8法檢測其體外增殖能力,描制生長曲線,用吉西他濱分別干預普通腫瘤細胞和PCSCs細胞,研究PCSCs的干性特征。
　　第二部分:用慢病毒載體介導的shRNA沉默PCSCs中Oct4和Nanog的表達,并用FQRT-PCR和Western blot檢測干擾效率。單克隆形成實驗、Transwell小室模型和CCK8法檢測Oct4和Nanog基因對PCSCs增殖、遷移

3、、侵襲和藥物敏感性的影響;FQRT-PCR和Western blot探討其作用機制。通過NOD/SCID小鼠致瘤實驗觀察Oct4和Nanog對PCSCs致瘤性的影響。
　　結果：
　　分選出的CD44+CD24+ESA+三陽性PCSCs細胞約占細胞總量的0.1％-0.8%,Oct4及Nanog基因在PCSCs細胞中表達高于Panc-1細胞,Oct4在PCSCs細胞中的表達高于Panc-1細胞8.141±1.378倍;Nano

4、g在PCSCs細胞中的表達高于Panc-1細胞7.945±0.652倍。Oct4和Nanog基因在兩種干細胞中均為核表達。Panc-1細胞PCSCs細胞體外培養(yǎng),Panc-1細胞第2天進入對數(shù)生長期,腫瘤干細胞體外無血清培養(yǎng)后第5天仍未進入對數(shù)生長期,呈干細胞球樣緩慢生長。吉西他濱刺激后細胞生長被抑制,第48H,測Panc-1細胞IC50值為982μg/mL,PCSCs細胞IC50值為1981μg/mL。第72H測Panc-1細胞IC5

5、0值為670μg/mL,PCSCs細胞IC50值為1484μg/mL,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);慢病毒載體介導shRNA可明顯降低PCSCs中Oct4、Nanog的表達(P<0.05)。沉默Oct4和Nanog后,PCSCs的單克隆形成、增殖、遷移、侵襲力較對照組顯著下降,藥物敏感性增強并誘導凋亡(P<0.05)。致瘤實驗表明PCSCs致瘤性在沉默Oct4和Nanog基因后,較對照組明顯下降(P<0.05)。
　　結論：<

6、br>　　1.通過流式細胞儀在胰腺癌Panc-1細胞株中分選出CD44+CD24+ESA+三陽性細胞,在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)緩慢生長及為耐受化療藥物的干細胞特性。
　　2.Oct4和Nanog基因在CD44+CD24+ESA+陽性PCSCs細胞中的表達高于普通胰腺癌細胞,說明這兩種基因與胰腺癌干細胞的干性特征相關。
　　3.慢病毒介導的shRNA可以沉默PCSCs中Oct4和Nanog基因的表達,可顯著抑制其干細胞性特征,增強藥物