胰腺癌干細(xì)胞Oct4、Nanog基因生物學(xué)特性的研究.pdf

1、目的：
　　研究胚胎干性相關(guān)基因Oct4和Nanog在人胰腺癌腫瘤干細(xì)胞(PCSCs)和普通腫瘤細(xì)胞中表達(dá)情況,然后再通過(guò)特異shRNA沉默PCSCs細(xì)胞中Oct4和Nanog的表達(dá),研究PCSCs干性特征的變化及其機(jī)制。
　　方法：
　　本實(shí)驗(yàn)分為兩大部分。
　　第一部分:用流式細(xì)胞儀在人胰腺癌Panc-1細(xì)胞系中以CD44+CD24+ESA+為表面標(biāo)記篩選PCSCs,RT-PCR法和細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)PCSC

2、s細(xì)胞和Panc-1細(xì)胞中Oct4和Nanog基因的表達(dá)情況。用CCK8法檢測(cè)其體外增殖能力,描制生長(zhǎng)曲線,用吉西他濱分別干預(yù)普通腫瘤細(xì)胞和PCSCs細(xì)胞,研究PCSCs的干性特征。
　　第二部分:用慢病毒載體介導(dǎo)的shRNA沉默PCSCs中Oct4和Nanog的表達(dá),并用FQRT-PCR和Western blot檢測(cè)干擾效率。單克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell小室模型和CCK8法檢測(cè)Oct4和Nanog基因?qū)CSCs增殖、遷移

3、、侵襲和藥物敏感性的影響;FQRT-PCR和Western blot探討其作用機(jī)制。通過(guò)NOD/SCID小鼠致瘤實(shí)驗(yàn)觀察Oct4和Nanog對(duì)PCSCs致瘤性的影響。
　　結(jié)果：
　　分選出的CD44+CD24+ESA+三陽(yáng)性PCSCs細(xì)胞約占細(xì)胞總量的0.1％-0.8%,Oct4及Nanog基因在PCSCs細(xì)胞中表達(dá)高于Panc-1細(xì)胞,Oct4在PCSCs細(xì)胞中的表達(dá)高于Panc-1細(xì)胞8.141±1.378倍;Nano

4、g在PCSCs細(xì)胞中的表達(dá)高于Panc-1細(xì)胞7.945±0.652倍。Oct4和Nanog基因在兩種干細(xì)胞中均為核表達(dá)。Panc-1細(xì)胞PCSCs細(xì)胞體外培養(yǎng),Panc-1細(xì)胞第2天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,腫瘤干細(xì)胞體外無(wú)血清培養(yǎng)后第5天仍未進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,呈干細(xì)胞球樣緩慢生長(zhǎng)。吉西他濱刺激后細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制,第48H,測(cè)Panc-1細(xì)胞IC50值為982μg/mL,PCSCs細(xì)胞IC50值為1981μg/mL。第72H測(cè)Panc-1細(xì)胞IC5

5、0值為670μg/mL,PCSCs細(xì)胞IC50值為1484μg/mL,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);慢病毒載體介導(dǎo)shRNA可明顯降低PCSCs中Oct4、Nanog的表達(dá)(P<0.05)。沉默Oct4和Nanog后,PCSCs的單克隆形成、增殖、遷移、侵襲力較對(duì)照組顯著下降,藥物敏感性增強(qiáng)并誘導(dǎo)凋亡(P<0.05)。致瘤實(shí)驗(yàn)表明PCSCs致瘤性在沉默Oct4和Nanog基因后,較對(duì)照組明顯下降(P<0.05)。
　　結(jié)論：<

6、br>　　1.通過(guò)流式細(xì)胞儀在胰腺癌Panc-1細(xì)胞株中分選出CD44+CD24+ESA+三陽(yáng)性細(xì)胞,在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)緩慢生長(zhǎng)及為耐受化療藥物的干細(xì)胞特性。
　　2.Oct4和Nanog基因在CD44+CD24+ESA+陽(yáng)性PCSCs細(xì)胞中的表達(dá)高于普通胰腺癌細(xì)胞,說(shuō)明這兩種基因與胰腺癌干細(xì)胞的干性特征相關(guān)。
　　3.慢病毒介導(dǎo)的shRNA可以沉默PCSCs中Oct4和Nanog基因的表達(dá),可顯著抑制其干細(xì)胞性特征,增強(qiáng)藥物