中藥調(diào)控種子細(xì)胞復(fù)合生物材料修復(fù)骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：各種原因引起的大段骨缺損很難愈合，隨著組織工程學(xué)理論與技術(shù)的發(fā)展，將具有成骨能力的種子細(xì)胞復(fù)合可降解生物材料構(gòu)建成具有生命活力的組織工程人工骨移植到骨缺損處，發(fā)揮骨誘導(dǎo)、骨傳導(dǎo)甚至直接成骨作用，成為這一棘手問題的新的解決方案。 中醫(yī)認(rèn)為，骨折后如腎生養(yǎng)精髓不足，則無以養(yǎng)骨而難以愈合，中醫(yī)治療骨折促進(jìn)骨折愈合，無不從補(bǔ)腎壯骨入手。如果能夠證實(shí)補(bǔ)腎壯骨中藥具有促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞(mesenchymai stem cells，MS

2、C)增殖、分化或兩者兼有的功能，就能從骨生長的細(xì)胞學(xué)層面上闡述這類藥物的具體作用機(jī)制和靶點(diǎn)。通過本研究希望解答以下問題：1．中藥骨碎補(bǔ)促進(jìn)骨折愈合(接骨續(xù)筋)的細(xì)胞學(xué)機(jī)制，即是否是骨髓基質(zhì)細(xì)胞—成骨細(xì)胞—骨生長—骨愈合的過程，為印證髓滿骨充理論提供依據(jù)；2．中藥參與培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞特性維持的能力，即是否具有穩(wěn)定增殖和傳代的能力；3．中藥參與培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞能否分化為成骨細(xì)胞，即骨髓基質(zhì)細(xì)胞的多潛能分化和定向分化能力的維持；4．骨碎補(bǔ)

3、提取物在細(xì)胞培養(yǎng)過程中的量效關(guān)系；5．這種特定條件下培養(yǎng)的種子細(xì)胞與生物基質(zhì)材料的復(fù)合是怎樣的，即能否制成具有生命活性的組織工程人工骨；6．該人工骨植入骨缺損處后的成骨效能如何。 一、骨碎補(bǔ)提取液對(duì)兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響 方法： 1．分組：實(shí)驗(yàn)共分五組：①空白對(duì)照組(標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液)；②誘導(dǎo)對(duì)照組(成骨條件誘導(dǎo)培養(yǎng)液)；③中藥Ⅰ組(含骨碎補(bǔ)20mg/ml的培養(yǎng)液)；④中藥Ⅱ組(含骨碎補(bǔ)2mg/ml的培養(yǎng)液)；⑤中藥

4、Ⅲ組(含骨碎補(bǔ)0.2mg/ml的培養(yǎng)液)。將從2月齡純種新西蘭大白兔提取的骨髓懸液分離漂洗出骨髓基質(zhì)細(xì)胞，加入以上培養(yǎng)液中培養(yǎng)。 結(jié)果： 1．細(xì)胞生長狀況 中藥Ⅰ組細(xì)胞貼壁數(shù)量少，生長緩慢，細(xì)胞形態(tài)細(xì)長，胞質(zhì)較少，細(xì)胞萎縮脫落?？瞻捉M細(xì)胞基本呈長梭形，其他各組細(xì)胞逐漸增多，伸出偽足，呈梭形、星形、多角形等不同形狀。胞漿內(nèi)有較多小顆粒，核仁明顯，一周左右細(xì)胞基本長滿并呈集落存在。 2．細(xì)胞活力及生長曲線的測

5、定結(jié)果 誘導(dǎo)組與空白組未見顯著性差異，中低濃度提取液有促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖作用，而低濃度較中濃度作用更強(qiáng)，高濃度提取液抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖，還能導(dǎo)致其凋亡。 3．細(xì)胞分裂指數(shù)的測定結(jié)果 測量分裂指數(shù)記錄并繪制成曲線，將貼片的細(xì)胞行HE染色，中藥Ⅰ組明顯抑制細(xì)胞生長，曲線低平。 結(jié)論：中低濃度骨碎補(bǔ)提取液促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖，而高濃度提取液抑制細(xì)胞增殖，甚至引起凋亡，條件誘導(dǎo)培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞增殖的影響不明顯。

6、 二、骨碎補(bǔ)提取液對(duì)兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化的影響 方法：骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)同上。 結(jié)果： 1．倒置相差顯微鏡觀察 中藥Ⅰ組細(xì)胞脫壁漂浮，數(shù)量明顯減少，細(xì)胞邊緣粗糙皺縮，核固縮，裂解。中藥Ⅱ、Ⅲ組、誘導(dǎo)對(duì)照組細(xì)胞呈梭形、多角形，融合為單層后繼續(xù)增殖成復(fù)層生長，形成多個(gè)島狀致密細(xì)胞群，中間細(xì)胞排列緊密，漸被含有高折射的空泡和深色顆粒的基質(zhì)包埋形成白色鈣化結(jié)節(jié)?？瞻讓?duì)照組，融合為單層后細(xì)胞發(fā)生接觸抑制，最終停

7、止分裂增殖。 2．掃描電鏡觀察 中藥Ⅱ、Ⅲ兩組細(xì)胞多為單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞為梭形或多角形，帶多個(gè)突起，數(shù)目不等，長短粗細(xì)各異，可見細(xì)長微絲形成細(xì)胞間的連接，細(xì)胞表面及細(xì)胞間可見鈣鹽結(jié)晶沉積。 3．堿性磷酸酶染色 中藥Ⅱ、Ⅲ組和誘導(dǎo)組染色陽性率分別為35.6％、31.4％和72.4％，空白組僅為3.6％。誘導(dǎo)組與空白對(duì)照組及中藥各組之間有極顯著性差異(P＜0.001)，中藥Ⅱ、Ⅲ組與空白組之間也有極顯著性差異

8、(P＜0.001)，中藥兩組之間無明顯差異(P＞0.05)。 4．Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色 各組Ⅰ型膠原在細(xì)胞內(nèi)和基質(zhì)均有陽性染色，誘導(dǎo)組與空白組有極顯著性差異(P＜0.001)，中藥Ⅱ、Ⅲ組雖明顯低于誘導(dǎo)組(P＜0.05)，但都明顯或顯著高于空白組(分別為P＜0.05，P＜0.01)，而中藥兩組之間無明顯差異(P＞0.05)。 5．鈣結(jié)節(jié)染色 中藥Ⅱ、Ⅲ組在每個(gè)標(biāo)本上均可見到金黃色鈣結(jié)節(jié)，低倍視野平均為

9、1～2個(gè)，少于誘導(dǎo)組的平均3～4個(gè)，而空白組僅偶見鈣結(jié)節(jié)。 結(jié)論：高濃度骨碎補(bǔ)醇提液引起了BMSCs的死亡或凋亡，不利于BMSCs向成骨細(xì)胞分化。中、低濃度骨碎補(bǔ)醇提液具有促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的作用。 三、成骨細(xì)胞與多孔支架材料的生物相容性研究 方法：傳代增殖的兔成骨細(xì)胞制成5×104/ml濃度的細(xì)胞懸液，置入已有支架材料的培養(yǎng)板中，使細(xì)胞懸液充分滲入支架材料孔隙內(nèi)聯(lián)合培養(yǎng)，8小時(shí)后加入條件培養(yǎng)液，其后隔

10、日更換培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)。 結(jié)果： 1．倒置相差顯微鏡和掃描電鏡觀察 培養(yǎng)7天，緊密貼附于支架表面的成骨細(xì)胞分化增殖連接成片，細(xì)胞多為梭形、三角形向周圍伸出偽足，分泌的基質(zhì)包繞于細(xì)胞周圍，充填于支架材料周邊孔隙中，可見鈣結(jié)節(jié)。 2．堿性磷酸酶染色 培養(yǎng)2周鈣鈷法在成骨細(xì)胞的胞漿中呈現(xiàn)淺棕色至棕黑色顆粒。 3．成骨細(xì)胞在支架材料上的成活和增殖能力 測定值為0.221±0.017，對(duì)照組

11、為0.140±0.015，(P〈0.01〉，表明支架有利于細(xì)胞的附著和增殖。 結(jié)論：成骨細(xì)胞在生物支架上分布均勻，粘附力強(qiáng)，并能很好地分化增殖及分泌新的骨基質(zhì)，生物活性玻璃能夠?yàn)榉N子細(xì)胞提供良好的載體和生存環(huán)境，二者生物相容性好。 四、組織工程人工骨修復(fù)兔骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究 方法： 將20只新西蘭大白兔分為4組，在其橈骨缺損處分別植入組織工程人工骨(Ⅰ組)、生物活性玻璃(Ⅱ組)、自體髂骨(Ⅲ組)，每組6只，

12、另2只保留骨缺損作為空白對(duì)照組(Ⅳ組)。縫合肌層皮膚包扎。術(shù)后每天肌注青霉素，連續(xù)三天，常規(guī)飼養(yǎng)。 結(jié)果： 1．大體觀察 12周Ⅰ組骨缺損區(qū)修復(fù)良好，與正常骨無差異；Ⅱ組骨缺損初步修復(fù)，有少量連續(xù)骨痂通過；Ⅲ組骨缺損完全修復(fù)，有連續(xù)性骨痂通過骨折端，質(zhì)地堅(jiān)硬；Ⅳ組假關(guān)節(jié)形成。 2．X線觀察 12周ⅠⅢ組骨缺損完全修復(fù)，可見皮質(zhì)骨及髓腔形成，皮質(zhì)骨厚度接近正常骨；Ⅱ組有少量連續(xù)性骨痂通過斷端；Ⅳ組骨

13、端硬化分離，形成假關(guān)節(jié)。 3．組織學(xué)觀察 12周Ⅰ組移植顆粒間骨橋和小梁狀結(jié)構(gòu)已建立，髓腔進(jìn)一步開通，逐步恢復(fù)自然骨的特點(diǎn)。Ⅱ組顆粒周圍形成少量新骨，顆粒間骨橋連接不緊密，骨小梁也不明顯。 4．掃描電鏡 12周Ⅲ組已形成隆起密集的結(jié)合，Ⅰ組分界模糊過渡自然，結(jié)合部密集。Ⅱ組也有明顯的修復(fù)，但不緊密。Ⅳ組全部為纖維組織，中央有裂隙。 5．生物力學(xué)測試結(jié)果顯示： Ⅲ組橈骨扭轉(zhuǎn)強(qiáng)度最高，與Ⅰ組無