細(xì)菌水通道蛋白及其生理功能探討.pdf

1、第一部分簡(jiǎn)并PCR探索10種細(xì)菌中的水通道蛋白 目的：用簡(jiǎn)并PCR方法擴(kuò)增幽門(mén)螺旋桿菌、綠膿桿菌、乙型副傷寒桿菌、痢疾志賀菌、金黃色葡萄球菌、檸檬色葡萄球菌、白色葡萄球菌、膿腫分枝桿菌、大腸桿菌的水通道蛋白DNA，以探討這10種細(xì)菌是否存在水通道蛋白，為進(jìn)一步探討水通道蛋白的生理功能奠定基礎(chǔ)。 方法： 以10種細(xì)菌全序列基因組DNA為模板，用細(xì)菌水通道蛋白的保守氨基酸序列設(shè)計(jì)細(xì)菌水通道蛋白的簡(jiǎn)并PCR通用引物，進(jìn)

2、行簡(jiǎn)并PCR擴(kuò)增，將得到的目的片段進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化、測(cè)序；BLAST比較基因序列，判定是否存在細(xì)菌水通道蛋白。 結(jié)果： 簡(jiǎn)并PCR產(chǎn)物純化、測(cè)序后在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)410bp大小序列，BLAST證實(shí)為水通道蛋白Glp-F。新發(fā)現(xiàn)在痢疾志賀菌中存在370bp大小序列，BLAST證實(shí)為水通道蛋白Glp-F。在其余8種細(xì)菌中未發(fā)現(xiàn)類(lèi)似水通道蛋白的 DNA。 結(jié)論： 本試驗(yàn)證實(shí)簡(jiǎn)并 PCR能夠利用已知的水通道蛋白

3、保守氨基酸序列擴(kuò)增未知的DNA序列。探索到大腸桿菌存在水通道蛋白Glp-F，與國(guó)外報(bào)道一致，表明簡(jiǎn)并 PCR能夠探索細(xì)菌水通道蛋白的存在；新發(fā)現(xiàn)痢疾志賀菌中存在細(xì)菌水通道蛋白Glp-F，而國(guó)外報(bào)道在福氏志賀菌中存在細(xì)菌水通道蛋白Glp-F，推測(cè)志賀菌各群中可能都存在水通道蛋白；本試驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)為探索水通道蛋白Glp-F生理作用奠定了基礎(chǔ)。有8種細(xì)菌經(jīng)簡(jiǎn)并PCR擴(kuò)增未得到目的條帶，表明水通道蛋白在細(xì)菌種群之間的分布存在不均一性。 第二

4、部分：高滲透壓誘導(dǎo)水通道蛋白Glp-F在痢疾志賀菌內(nèi)表達(dá) 目的：用滲透壓不同的液體培養(yǎng)基和含有Hg<'2+>(Glp-F選擇性抑制劑)的不同滲透壓培養(yǎng)基對(duì)痢疾志賀菌進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)菌體內(nèi)Glp-F的表達(dá)，以探討Glp-F蛋白在菌體內(nèi)的生理功能。 方法： 1．配置不同滲透壓培養(yǎng)基：普通牛肉浸液培養(yǎng)基；用無(wú)菌水稀釋為含1/3、1/2牛肉浸液的培養(yǎng)基；加入NaCl使?jié)B透濃度達(dá)到125mM、250mM、500mM、750m

5、M培養(yǎng)基(N-原、N-1/3、N-1/2、N-125mM、N-250mM、N-500mM、N-750mM培養(yǎng)基)。 2．配置含有Hg<'2+>抑制劑的不同滲透壓培養(yǎng)基：在上述培養(yǎng)基中分別加入Glp-F的功能抑制劑HgCl<,2>2mg得到H-原、H-1/3、H-1/2、H-125mM、H-250mM、H-500mM、H-750mM培養(yǎng)基。 3．在上述各種培養(yǎng)基中接種痢疾志賀菌，分別于24，48，72，96小時(shí)培養(yǎng)點(diǎn)上觀察

6、細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其OD600值以評(píng)價(jià)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。 4．用RT-PCR擴(kuò)增Glp-F的mRNA，瓊脂糖凝膠電泳、染色、成像分析，比較在不同環(huán)境條件下生長(zhǎng)的痢疾志賀菌Glp-F的mRNA轉(zhuǎn)錄量。 結(jié)果： 1．低滲透壓環(huán)境中培養(yǎng)的痢疾志賀菌在各個(gè)觀測(cè)點(diǎn)的生長(zhǎng)無(wú)明顯差異。 2．在N-培養(yǎng)基和H-培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況出現(xiàn)顯著不同：在H-培養(yǎng)基中細(xì)菌生長(zhǎng)速度明顯低于在N-培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度，特別是在

7、125mM、250mM濃度培養(yǎng)基中變化最大。 3．RT-PCR顯示痢疾志賀菌Glp-F的mRNA含量在普通培養(yǎng)基、稀釋 1/3、1/2 水的牛肉浸液培養(yǎng)基、N-500mM/750Mm、H-N-500mM/750Mm培養(yǎng)基中沒(méi)有明顯差異；在N-125mM/250mM培養(yǎng)基和H-125mM/250mM中含量明顯增多，在H-125mM/250mM培養(yǎng)基中，細(xì)菌mRNA轉(zhuǎn)錄量大于在N-125mM/250mM培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)錄量。 結(jié)

8、論：Glp-F是細(xì)菌特有的水通道蛋白，探討Glp-F的生理功能對(duì)研究細(xì)菌的水通蛋白有重要意義，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)的結(jié)果可以得到以下結(jié)論： 1．表達(dá)Glp-F 蛋白的痢疾志賀菌在低滲透壓下生長(zhǎng)繁殖速度沒(méi)有明顯變化。 2．在高滲透壓環(huán)境中，痢疾志賀菌的生長(zhǎng)繁殖速度隨著Glp-F蛋白功能的喪失而降低。 3．Glp-F的mRNA的在生長(zhǎng)期內(nèi)有不同的轉(zhuǎn)錄，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)尤為明顯，與國(guó)外報(bào)道相似。 4．滲透壓的升高