軟骨內(nèi)FGFR3功能缺失在小鼠骨形成及骨折愈合過(guò)程中的影響及作用機(jī)制研究.pdf

1、成纖維生長(zhǎng)因子受體3(Fibroblastgrowthfactorreceptor3)是受體酪氨酸激酶FGFRs家族成員之一。FGFR3功能增強(qiáng)型點(diǎn)突變可導(dǎo)致多種骨骼發(fā)育不良性遺傳疾病,包括軟骨發(fā)育不良(Achondroplasia,ACH),季肋發(fā)育不良(Hypochondroplasia,HCH)及致死性軟骨不全(Thanatophoricdysplasia,TD)。這些疾病多表現(xiàn)為軟骨內(nèi)成骨過(guò)程發(fā)生變化。模擬人ACH的FGFR3功

2、能增強(qiáng)小鼠(Fgfr3G369C/+)個(gè)體短小、頭顱短圓、長(zhǎng)骨生長(zhǎng)板組織形態(tài)結(jié)構(gòu)異常,進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)其軟骨細(xì)胞增殖帶短稀,軟骨細(xì)胞增殖能力減弱、肥大軟骨細(xì)胞明顯減少。相反,FGFR3基因敲除小鼠(Fgfr3-/-)則表現(xiàn)為長(zhǎng)骨過(guò)度生長(zhǎng),生長(zhǎng)板軟骨增殖、肥大帶變寬、軟骨細(xì)胞增殖活性增加。上述結(jié)果表明,FGFR3是軟骨內(nèi)成骨過(guò)程的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,它主要通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞增殖、分化來(lái)阻遏骨骼發(fā)育過(guò)程中的軟骨內(nèi)成骨過(guò)程。
　　除影響軟骨內(nèi)成骨

3、外,目前有較多線索提示FGFR3可直接參與調(diào)控骨形成。Fgfr3-/-小鼠長(zhǎng)骨鈣化障礙,骨密度降低、骨質(zhì)減少,易骨折;ACH小鼠骨小梁厚度及數(shù)量減少,礦化受抑制,Cbfa1、OC、OP等表達(dá)增強(qiáng),提示FGFR3功能增強(qiáng)促進(jìn)骨形成。FGFR3在成骨細(xì)胞中表達(dá)較低,但骨形成卻有明顯改變,且Fgfr3-/-小鼠與ACH小鼠都存在骨量減少的表型。近年研究發(fā)現(xiàn),軟骨細(xì)胞可分泌IHH、BMP4等分子影響成骨細(xì)胞進(jìn)而影響骨小梁的發(fā)生。軟骨內(nèi)激活突變C

4、ol2-Fgfr3Y367C/+及全身激活突變小鼠CMV-Fgfr3Y367C/+表型類(lèi)似。上述提示FGFR3在直接影響成骨細(xì)胞同時(shí)也可通過(guò)軟骨細(xì)胞間接影響骨形成。
　　骨折愈合過(guò)程與骨發(fā)育過(guò)程類(lèi)似。許多骨折愈合的研究也同樣表明FGFR3參與其中。FGFR3在負(fù)性調(diào)節(jié)骨發(fā)育的同時(shí),同樣能夠抑制軟骨形成從而延緩骨折愈合過(guò)程。那么在軟骨內(nèi)FGFR3功能缺失小鼠中,其骨折愈合過(guò)程是否存在變化?
　　綜上,我們通過(guò)建立軟骨內(nèi)敲除FG

5、FR3小鼠(FGFR3fl/fl-Col2Cre),觀察其骨骼表型變化,并制作小鼠脛骨穩(wěn)定性骨折模型觀察其骨損傷修復(fù),結(jié)合BMSC分化誘導(dǎo)等細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)探討FGFR3通過(guò)軟骨間接影響骨形成及骨折愈合的機(jī)制。
　　主要實(shí)驗(yàn)方法:
　　一、軟骨內(nèi)FGFR3功能缺失對(duì)骨形成影響
　　1.測(cè)量Fgfr3fl/fl-Col2Cre體重、身長(zhǎng)、股骨長(zhǎng)度、脛骨長(zhǎng)度及尾長(zhǎng)比較其和野生型發(fā)育情況;
　　2.利用Micro-CT及X光

6、等手段分析Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠股骨骨量等指標(biāo),明確Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠在成年期骨量變化;
　　3.通過(guò)全骨架染色觀察Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠早期形態(tài)變化及顱底軟骨連接有無(wú)改變,通過(guò)全骨架染色觀察次級(jí)骨化中心出現(xiàn)時(shí)間有無(wú)改變,利用藏紅固綠染色及H&E染色觀察生長(zhǎng)板形態(tài)變化;
　　4.利用原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)及BMSC了解礦化及成骨活性等指標(biāo)變化;
　　5.通過(guò)TRAP染

7、色并進(jìn)行形態(tài)計(jì)量從而觀察破骨細(xì)胞功能活性有無(wú)改變確定引起骨形成改變的原因;
　　6.利用原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)定量檢測(cè)軟骨細(xì)胞分泌IHH、BMP、VEGF、Noggin等信號(hào)分子表達(dá)進(jìn)而確定軟骨細(xì)胞影響成骨細(xì)胞的可能機(jī)制。
　　二、軟骨內(nèi)FGFR3功能缺失對(duì)骨折愈合影響
　　1.建立小鼠脛骨穩(wěn)定性骨折模型;
　　2.利用X線掃描及Micro-CT確定骨折愈合快慢有無(wú)變化;
　　3.利用藏紅固綠及H&E染色觀察骨折

8、斷端細(xì)胞形態(tài);
　　主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　一、Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠通過(guò)間接作用引起骨形成改變
　　1.Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠早期及成年期形態(tài)均存在形態(tài)改變,鼠尾彎曲變形;
　　2.Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠骨形成過(guò)程加快
　　1)X光及Micro-CT掃描分析Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠在1m齡及4m齡均骨量增加,骨小梁區(qū)域長(zhǎng)度增加。
　　

9、2)Fgfr3fl/fl-Col2Cre生次級(jí)骨化中心出現(xiàn)延遲但顱底軟骨連接閉合無(wú)明顯變化。生長(zhǎng)板增殖軟骨細(xì)胞活性增強(qiáng),肥大軟骨細(xì)胞帶增寬。
　　3)鈣黃綠素?zé)晒怆p標(biāo)檢測(cè)Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠骨形成速率增加。
　　4)原代成骨細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ALP活性無(wú)變化,礦化無(wú)障礙。BMSC誘導(dǎo)成骨細(xì)胞后檢測(cè)礦化無(wú)障礙,但ALP活性降低,增殖減慢。
　　3.Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠破骨細(xì)胞數(shù)量減少,破

10、骨細(xì)胞活性降低;
　　4.軟骨內(nèi)FGFR3功能缺失后間接影響骨形成
　　原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)后定量PCR檢測(cè)mRNA表達(dá),IHH表達(dá)升高,VEGF降低,BMP2/7無(wú)明顯差異但BMP抑制分子Noggin表達(dá)降低。
　　二、Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠骨折愈合加快
　　1.Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠骨折愈合加快
　　X線及Micro-CT掃描發(fā)現(xiàn),Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠

11、在術(shù)后7天時(shí)已進(jìn)入骨痂形成期,而野生型小鼠仍處于血腫機(jī)化期。在術(shù)后14d時(shí)Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠已有鈣化骨痂出現(xiàn)而野生型小鼠仍以大量軟骨痂覆蓋于骨折斷端。術(shù)后21d時(shí)Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠已幾乎愈合而野生型小鼠仍有大量骨痂存在。
　　2.Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠軟骨細(xì)胞增殖活性增加,肥大軟骨細(xì)胞功能增強(qiáng)
　　藏紅固綠及H&E染色結(jié)果可見(jiàn),在術(shù)后7天Fgfr3fl/fl-Co

12、l2Cre小鼠骨折斷端周?chē)霈F(xiàn)肥大軟骨細(xì)胞;野生型小鼠骨折斷端處則主要是增殖軟骨細(xì)胞。術(shù)后14天可見(jiàn)Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠骨痂內(nèi)可見(jiàn)松質(zhì)骨形成,其周?chē)街罅糠蚀筌浌羌?xì)胞,增殖軟骨細(xì)胞少見(jiàn);野生型小鼠軟骨痂明顯較少,增殖軟骨細(xì)胞較多,新生松質(zhì)骨少見(jiàn)。在術(shù)后21天,Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠形態(tài)已接近恢復(fù)僅存在少量肥大軟骨細(xì)胞;而野生型小鼠軟骨痂中仍有大量肥大軟骨細(xì)胞。
　　主要結(jié)論:
　　一、

13、軟骨內(nèi)FGFR3功能缺失小鼠骨形成加快
　　1.Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠四肢過(guò)度生長(zhǎng),鼠尾彎曲,骨量增加骨量增加;
　　2.軟骨內(nèi)FGFR3功能缺失小鼠骨形成過(guò)程加快,次級(jí)骨化中心出現(xiàn)延遲,顱底軟骨連接無(wú)改變,顱骨成骨細(xì)胞礦化無(wú)障礙,成骨活性無(wú)改變,BMSC礦化無(wú)障礙,ALP總活性降低但定量結(jié)果升高;生長(zhǎng)板中肥大軟骨細(xì)胞帶增寬,增殖軟骨細(xì)胞活性增強(qiáng),骨形成速率加快;
　　3.軟骨內(nèi)FGFR3功能缺失小鼠