FGFR3在骨重塑調(diào)節(jié)過程中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、成纖維生長因子受體家族（FGFRs）共有四個(gè)成員：FGFR1、FGFR2、FGFR3及FGFR4。四個(gè)受體分別通過與FGF結(jié)合發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活胞內(nèi)信號(hào)從而發(fā)揮其生理功能。其中FGFR3主要負(fù)性調(diào)節(jié)軟骨發(fā)育。FGFR3功能增強(qiáng)點(diǎn)突變可引起軟骨發(fā)育障礙導(dǎo)致一系列人類骨骼遺傳?。很浌前l(fā)育不全(ACH),季肋發(fā)育不良(HCH)以及致死性軟骨發(fā)育不全(TD)。通過建立模擬人類相關(guān)遺傳病的FGFR3點(diǎn)突變小鼠（ACH小鼠）模型，發(fā)現(xiàn)FGFR3增強(qiáng)

2、導(dǎo)致骨形成過程障礙、骨量降低，同時(shí)肥大軟骨細(xì)胞分化受到抑制。FGFR3敲除小鼠雖生長板增寬、肥大軟骨細(xì)胞分化增強(qiáng)，但該小鼠與增強(qiáng)小鼠同樣表現(xiàn)為骨量降低、皮質(zhì)骨變薄。上述兩種小鼠是在所有細(xì)胞中敲除或增強(qiáng)FGFR3，無法區(qū)分FGFR3在特定細(xì)胞中的作用。
　　在骨骼發(fā)育過程中，軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞間的串話是影響軟骨內(nèi)成骨過程的重要環(huán)節(jié)。在 ACH小鼠模型中，軟骨細(xì)胞肥大分化過程受到抑制，由成骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨形成減慢。前期研究表明

3、，在軟骨內(nèi)特異性敲除FGFR3引起B(yǎng)MP2/4/7表達(dá)增高，同時(shí)BMPs拮抗抑制分子Noggin表達(dá)降低；同時(shí)IHH表達(dá)增高明顯。這些結(jié)果證實(shí)了軟骨細(xì)胞中的FGFR3水平降低可引起促成骨細(xì)胞相關(guān)分子表達(dá)增加。但敲除FGFR3軟骨細(xì)胞中的這些信號(hào)分子是否能影響成骨細(xì)胞有待進(jìn)一步證實(shí)。另一方面軟骨細(xì)胞能夠通過與破骨細(xì)胞串話進(jìn)而引起骨重塑過程的改變。但軟骨細(xì)胞中缺失FGFR3后是否可以直接調(diào)節(jié)破骨吸收過程，還是先通過改變成骨細(xì)胞功能而后影響破

4、骨吸收過程尚不清楚。因此我們擬通過成骨-軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)模型來明確敲除 FGFR3的軟骨細(xì)胞是如何調(diào)控軟骨內(nèi)成骨過程。
　　FGFR3除通過調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞功能間接影響骨形成外，也可直接影響小鼠成骨過程。參與骨形成過程中的成骨細(xì)胞主要來源于間充質(zhì)細(xì)胞，歷經(jīng)成骨前體細(xì)胞，分化成為成熟成骨細(xì)胞。成熟成骨細(xì)胞能分泌類骨質(zhì)與胞外基質(zhì)。隨著鈣的沉積類骨質(zhì)礦化，將成熟成骨細(xì)胞包埋其中。模擬人軟骨發(fā)育不全的FGFR3增強(qiáng)型點(diǎn)突變小鼠模型表現(xiàn)為成骨細(xì)胞

5、增殖減慢，礦化障礙，但ALP活性增高，并且進(jìn)一步證實(shí)FGFR3通過P38通路抑制間充質(zhì)細(xì)胞增殖，又通過ERK1/2調(diào)節(jié)礦化過程。使用Col1啟動(dòng)子介導(dǎo)的早期成骨細(xì)胞 FGFR3功能增強(qiáng)小鼠表現(xiàn)為骨量明顯減少，早期成骨細(xì)胞標(biāo)志基因 Col1表達(dá)增高，但OP表達(dá)無變化。這些結(jié)果均提示FGFR3能直接調(diào)控早期成骨細(xì)胞功能。但成熟成骨細(xì)胞中 FGFR3功能發(fā)生改變是否會(huì)引起骨重塑過程發(fā)生變化需要進(jìn)一步研究。
　　終末成熟成骨細(xì)胞除凋亡、轉(zhuǎn)

6、變?yōu)楣且r細(xì)胞兩種命運(yùn)轉(zhuǎn)歸外，還能轉(zhuǎn)變?yōu)樯嬗诠琴|(zhì)中的骨細(xì)胞。骨細(xì)胞是人體骨組織中數(shù)量最多、壽命最長、分布最廣的成骨系細(xì)胞。骨細(xì)胞近年來也被證實(shí)能夠通過旁分泌途徑調(diào)節(jié)骨重塑過程。骨細(xì)胞可以通過樹突與骨質(zhì)表面附著的成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞產(chǎn)生串話，傳遞信號(hào)。壓力或化學(xué)信號(hào)刺激能引起骨細(xì)胞SOST水平變化，從而影響成骨細(xì)胞分化及功能。另外骨細(xì)胞還可通過分泌RANKL調(diào)節(jié)破骨吸收功能。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)均表明FGFR3在骨細(xì)胞中表達(dá)，因此我們推測FG

7、FR3可能參與骨細(xì)胞功能維持，并參與骨重塑過程。
　　研究方法:
　　第一部分FGFR3在骨細(xì)胞中的作用及機(jī)制研究
　　1.建立骨細(xì)胞敲除FGFR3小鼠模型：通過將Fgfr3flox/flox小鼠與Dmp1-Cre小鼠交配，獲得子代為 Dmp1-Cre；Fgfr3flox/flox小鼠。該小鼠中 FGFR3在骨細(xì)胞中被特異性敲除。Dmp1-Cre；Fgfr3flox/flox小鼠與同窩Fgfr3flox/flox小鼠于

8、3月齡及6月齡取材，獲得股骨、脛骨用于實(shí)驗(yàn)；
　　2.利用免疫組化檢測FGFR3與OC蛋白水平變化，同時(shí)取3月齡小鼠股骨及脛骨提取骨組織RNA定量分析FGFR3的表達(dá)；
　　3.通過數(shù)字X光成像掃描小鼠股骨、尾椎骨等觀察小梁骨及皮質(zhì)骨影像學(xué)變化，通過Micro-CT三維重建股骨掃描數(shù)據(jù)，分別量化評(píng)估小鼠小梁骨及皮質(zhì)骨；
　　4.使用染色骨組織石蠟切片從組織學(xué)評(píng)估骨量、成骨細(xì)胞數(shù)量、成骨細(xì)胞表面積等指標(biāo)，使用硬組織切片進(jìn)

9、行熒光雙色雙標(biāo)評(píng)價(jià)骨形成速率，Von Kossa染色用來觀察小梁骨表面是否存在礦化差異。
　　5.通過TRAP染色觀察破骨細(xì)胞數(shù)量及破骨吸收表面積，同時(shí)使用骨組織RNA定量檢測其中RankL和Opg表達(dá)變化；
　　6. TUNEL法用以檢測骨組織中骨細(xì)胞凋亡情況。
　　第二部分成熟成骨細(xì)胞中FGFR3的功能研究
　　1.建立成熟成骨細(xì)胞內(nèi)特異性敲除FGFR3小鼠模型并觀察其整體表型；
　　2.利用 X線觀察

10、成熟成骨細(xì)胞內(nèi)特異性敲除 FGFR3小鼠骨骼表型，Micro-CT掃描重建則用于評(píng)估敲除小鼠骨骼相關(guān)指標(biāo)，明確其骨量變化；
　　3.熒光雙標(biāo)檢測敲除小鼠骨形成速率，Von Kossa染色用于觀察小鼠骨量及未礦化類骨質(zhì)有無異常沉積，OC免疫組化用于觀察成骨細(xì)胞功能；
　　4.使用TRAP染色觀察成熟成骨細(xì)胞內(nèi)特異性敲除FGFR3后小鼠破骨細(xì)胞形成情況；
　　第三部分FGFR3通過旁分泌作用調(diào)節(jié)骨形成
　　1.成骨-

11、軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞體系的建立：分離了出生后1-3天的Fgfr3flox/flox小鼠(WT)和 Col2-Cre；Fgfr3flox/flox(MUT)小鼠原代軟骨細(xì)胞和 WT小鼠顱骨原代成骨細(xì)胞。通過Trans-well共培養(yǎng)系統(tǒng)，上層分別接種WT和MUT小鼠原代軟骨細(xì)胞，下層接種WT顱骨原代成骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；
　　2.通過茜素紅及 ALP染色觀察成骨-軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)下層成骨細(xì)胞礦化情況及ALP陽性細(xì)胞數(shù)量，并且通過ALP定量檢

12、測ALP活性是否發(fā)生變化；
　　3.提取共培養(yǎng)14天的原代成骨細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)后通過定量PCR檢測成骨相關(guān)基因Cbfa1、Col1、OC的表達(dá)觀察成骨細(xì)胞功能變化；
　　4.提取原代軟骨細(xì)胞RNA并定量檢測軟骨細(xì)胞中RankL和Opg表達(dá)變化，同時(shí)使用上述共培養(yǎng)體系下層原代成骨細(xì)胞RNA定量檢測成骨細(xì)胞中RankL和Opg水平變化，明確引起MUT小鼠破骨吸收功能降低的原因；
　　5.提取成骨-軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)上層原代軟骨

13、細(xì)胞RNA，定量檢測TGF-β1、TGF-βi、Wnt2、Wnt3、Wnt4、Wnt5b表達(dá)，探尋軟骨細(xì)胞中FGFR3影響骨形成的潛在細(xì)胞串話機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　一、 FGFR3在骨細(xì)胞中的作用及機(jī)制研究
　　1.使用Dmp1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Cre工具小鼠可在骨細(xì)胞中有效敲除FGFR3；
　　2.骨細(xì)胞 FGFR3失活（Dmp1-Cre；Fgfr3flox/flox）引起小鼠骨量降低，骨小梁厚度及數(shù)量減少，骨

14、小梁間隙增寬，同時(shí)皮質(zhì)骨厚度變薄，皮質(zhì)骨骨體積減少；
　　3.骨細(xì)胞內(nèi)FGFR3失活后，骨小梁雙色雙標(biāo)間距變窄，骨形成速率減慢；
　　4. Dmp1-Cre；Fgfr3flox/flox小鼠與同窩Fgfr3flox/flox小鼠相比，骨小梁表面成骨細(xì)胞數(shù)量減少明顯，成骨細(xì)胞鋪展表面積降低，髓腔內(nèi)側(cè)皮質(zhì)骨表面成骨細(xì)胞形態(tài)變?yōu)楸馄?，提示其生成骨能力減弱；
　　5. Dmp1-Cre；Fgfr3flox/flox小鼠小梁骨及

15、髓內(nèi)側(cè)皮質(zhì)骨破骨細(xì)胞增多、破骨吸收表面積增加顯著，同時(shí)骨組織RNA結(jié)果提示RankL/Opg增高，提示Dmp1-Cre；Fgfr3flox/flox小鼠破骨吸收能力增強(qiáng)；骨細(xì)胞凋亡無明顯改變。
　　二、成熟成骨細(xì)胞中FGFR3的功能研究
　　1.成熟成骨細(xì)胞內(nèi)特異性FGFR3功能失活小鼠體型變短，體重減輕，同時(shí)骨量降低顯著；
　　2.成熟成骨細(xì)胞內(nèi)特異性敲除FGFR3小鼠骨形成障礙，成骨細(xì)胞數(shù)量降低，同時(shí)OC表達(dá)降低，

16、成骨細(xì)胞分化能力減弱；
　　3.成熟成骨細(xì)胞內(nèi)特異性FGFR3功能失活小鼠破骨吸收能力無變化；
　　三、FGFR3通過細(xì)胞間串話調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)成骨過程
　　1.通過成骨-軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)后，成骨細(xì)胞礦化能力增強(qiáng)，ALP活性增高，同時(shí)成骨相關(guān)標(biāo)志基因Col1、OC、Cbfa1表達(dá)增高；
　　2.除軟骨細(xì)胞Ihh、Bmp2/4/7增高，Noggin降低以外，Wnt-4、TGF-β1表達(dá)增高；
　　3.成骨-軟骨細(xì)胞共