FGF8及FGFR3在大骨節(jié)病軟骨細(xì)胞異常分化過程中的作用研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　大骨節(jié)?。↘ashin-Beck disease,KBD）是一種慢性、地方性、變形性骨關(guān)節(jié)病，致殘率很高，嚴(yán)重危害人民健康。我國曾將KBD列為衛(wèi)生部“六五”、國家“七五”和“八五”科技攻關(guān)項(xiàng)目。但是，KBD發(fā)病機(jī)理不清，就推定的病因物質(zhì)在人體內(nèi)如何損傷深層軟骨細(xì)胞，一直未獲得證據(jù)，迄今不能解釋KBD軟骨深層壞死的發(fā)病機(jī)制。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，KBD的軟骨壞死與氧化應(yīng)激有關(guān)，KBD的發(fā)生發(fā)展是以自由基引起的氧化

2、應(yīng)激損傷作用為核心的病理過程。KBD軟骨壞死以侵犯骺生長板和關(guān)節(jié)軟骨的深層軟骨細(xì)胞為主，由于透明軟骨特殊的組織結(jié)構(gòu)，在國內(nèi)外的研究中，只要涉及關(guān)節(jié)和骺板軟骨肥大層的病變，就會關(guān)注軟骨細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)作用。
　　成纖維細(xì)胞生長因子8(Fibroblast Growth Factor8，F(xiàn)GF8)是于90年代由外國學(xué)者在SC3即雄性激素依賴性小鼠乳腺癌細(xì)胞系中分離出來的，因此又被稱為雄激素誘導(dǎo)的生長因子(androgen induced

3、 growth factor，AIFGF)。人體中的成纖維生長因子8是由233個氨基酸構(gòu)成(其分子量約26 kDa)的堿性蛋白，等電電位點(diǎn)為105左右。其在細(xì)胞早期分化過程中起舉足輕重的作用，并與頭骨和大腦以及手腳骨骼等等的形成有著密切的聯(lián)系，是由受精卵發(fā)育至胚胎這個過程中不可或缺的生長因子之一。成纖維細(xì)胞生長因子受體3(Fibroblast Growth Factor Receptor3，F(xiàn)GFR3)屬于一類酪氨酸蛋白激酶(recep

4、tor tyrosine kinase,RTK)。至今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了4種成纖維細(xì)胞生長因子受體,即FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4。它們之間在氨基酸水平有55％~72%的一致性。通過既往研究我們得知,成纖維細(xì)胞生長因子受體3的信號通路與軟骨的發(fā)育、再造和骨骼疾病有著緊密的聯(lián)系。而成纖維細(xì)胞生長因子受體1,2,3的功能喪失突變或增強(qiáng)可導(dǎo)致包括顱縫早閉(craniosynostosis,CS)、軟骨發(fā)育不全(achondrop

5、lasia,ACH)和CATSHL(camptodactyly,tall stature。scoliosis。and hearing loss)綜合征在內(nèi)的多種人類骨骼系統(tǒng)遺傳性疾病。在已經(jīng)報(bào)道的既往研究發(fā)現(xiàn)，KBD軟骨內(nèi)成骨障礙的發(fā)生涉及深層軟骨細(xì)胞終末過程的分化異常，分化調(diào)節(jié)因子即成纖維細(xì)胞生長因子，甲狀旁腺激素相關(guān)肽(Parathyroid Hormone related Peptide,PTHrp)，轉(zhuǎn)化生長因子-β等表達(dá)異常，

6、但這些異常表達(dá)的分化因子以及引起軟骨細(xì)胞的終末分化障礙與 KBD深層軟骨死亡的關(guān)系未見研究。
　　本研究擬以氧化應(yīng)激所誘發(fā)的軟骨細(xì)胞分化調(diào)節(jié)障礙為切入點(diǎn)，通過檢測成纖維細(xì)胞生長因子8及其受體3在軟骨細(xì)胞異常分化中的表達(dá)為介導(dǎo)，分析其與大骨節(jié)病患者的關(guān)系，并初步研究FGF以及FGFR在大骨節(jié)病的發(fā)生過程當(dāng)中的生物學(xué)功能，試圖揭示KBD軟骨深層壞死的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)而為進(jìn)一步闡明KBD的病因研究和防治提供理論依據(jù)。
　　研究方法：<

7、br>　　本研究采用實(shí)時熒光定量Real-Time PCR、Western Blotting和免疫組織化學(xué)技術(shù)等方法，篩選異常表達(dá)的與軟骨分化相關(guān)的分化調(diào)節(jié)因子-成纖維細(xì)胞生長因子及其受體，檢測其在KBD兒童和動物模型軟骨的表達(dá)水平，對KBD的病因及發(fā)病機(jī)制研究提供新的思路。
　　統(tǒng)計(jì)方法：
　　t檢驗(yàn)主要用于大骨節(jié)病人組織與正常人對照組織的FGF8和FGFR3在免疫組織化學(xué)水平上陽性率表達(dá)差異的比較；動物模型的免疫組織化學(xué)

8、水平上的差異比較用方差分析；卡方檢驗(yàn)主要用于高表達(dá)組和低表達(dá)組的FGF8和 FGFR3在mRNA水平以及蛋白質(zhì)水平上的差異比較。
　　結(jié)果：
　　1.各組SIN-1濃度梯度誘導(dǎo)下的小鼠關(guān)節(jié)軟骨肥大細(xì)胞中FGF8以及FGFR3的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平有差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p?0.05）。與誘導(dǎo)成功的小鼠關(guān)節(jié)軟骨肥大細(xì)胞對照組即SIN-10mmol（不加藥）組相比，F(xiàn)GF8及FGFR3表達(dá)量上調(diào)，尤其是在ADTC5小鼠

9、肥大軟骨細(xì)胞系中。
　　2.在低硒條件下T-2毒素誘導(dǎo)的四組SD大鼠大骨節(jié)病模型的新鮮組織蛋白以及石蠟病理切片中檢測異常表達(dá)的FGF8及FGFR3的表達(dá)水平，四組模型組織蛋白表達(dá)水平有差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p?0.05）；四組模型石蠟病理切片的陽性率有差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p?0.05）。與常規(guī)組相比，低硒組，常規(guī)+T-2組，低硒+T-2組中FGF8及FGFR3的表達(dá)水平上調(diào)。
　　3.免疫組織化學(xué)法檢測了64例石蠟

10、包埋軟骨組織中FGF8以及FGFR3蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在兒童大骨節(jié)病患者手指關(guān)節(jié)軟骨和成人KBD病人關(guān)節(jié)軟骨中，F(xiàn)GF8以及FGFR3蛋白表達(dá)主要在細(xì)胞漿中，且病例組與對照組FGF8及FGFR3的陽性表達(dá)率具有差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p?0.05）。
　　結(jié)論：
　　FGF8及FGFR3在大骨節(jié)病軟骨細(xì)胞異常分化過程中具有重要作用，兩個蛋白在軟骨分化等功能上均為負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，F(xiàn)GF8及FGFR3的表達(dá)上調(diào)可能會引起大骨節(jié)病