鼓泡塔生物反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)紅豆杉細(xì)胞的防御應(yīng)答.pdf

1、為了研究懸浮培養(yǎng)的紅豆杉細(xì)胞對鼓泡引起的流體剪切環(huán)境的防御應(yīng)答機制，通過對三種不同鼓泡孔徑的反應(yīng)器的湍動剪切力進行定量分析，探討了鼓泡引起的紅豆杉細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄、蛋白酶表達以及磷脂代謝水平上的變化，試圖為工程化放大研究提供一些理論依據(jù)。
　　 采用激光多普勒測速方法，分別對3個不同鼓泡孔徑(1.0mm、1.5mm和2.0mm)的反應(yīng)器內(nèi)的湍動剪切力進行了研究。通過計算比較反應(yīng)器不同區(qū)域的湍動剪切力場，發(fā)現(xiàn)軸向雷諾應(yīng)力最大，其數(shù)值在

2、2.0 N/m2到7.2 N/m2之間；反應(yīng)器內(nèi)三個區(qū)域的湍動剪切力的大小順序為：氣液界面處＞鼓泡通氣口以下＞鼓泡塔主體區(qū)域；對比3個不同鼓泡孔徑的反應(yīng)器發(fā)現(xiàn)，靠近氣液界面處湍動剪切力隨著鼓泡孔徑的減小而增大。從流體剪切力的角度證實了氣液界面是細(xì)胞損傷的主要區(qū)域，而且小鼓泡孔徑引起的流體湍動程度最強。
　　 運用RT-PCR方法，探討了鼓泡對紫杉醇合成相關(guān)的3個基因(hmgr、dxr和ts)的轉(zhuǎn)錄水平的影響。在短期培養(yǎng)過程中，與

3、搖瓶培養(yǎng)的細(xì)胞相比，鼓泡塔中hmgr和dxr基因的轉(zhuǎn)錄水平分別降低了53.1％，41.5％(1.5mm鼓泡孔徑)和64.2％，53.8％(1.0mm鼓泡孔徑)，ts基因沒有顯著變化；在長期培養(yǎng)過程中，3個基因的轉(zhuǎn)錄水平在培養(yǎng)的6-11天，轉(zhuǎn)錄水平迅速增加，以后逐漸降低，hmgr在第11天的轉(zhuǎn)錄活性分別達到了搖瓶的1.59倍(1.5mm鼓泡孔徑)和1.31倍(1.0mm鼓泡孔徑)，同時期dxr的轉(zhuǎn)錄活性分別為搖瓶的1.51倍(1.5mm鼓

4、泡孔徑)和1.31倍(1.0mm鼓泡孔徑)，ts的轉(zhuǎn)錄活性分別為搖瓶的1.47倍(1.5mm鼓泡孔徑)和1.26倍(1.0mm鼓泡孔徑)。
　　 研究了鼓泡孔徑分別為1.0mm和1.5mm的反應(yīng)器中剪切環(huán)境脅迫下引起的細(xì)胞防御應(yīng)答。結(jié)果表明，反應(yīng)器中細(xì)胞在8h后產(chǎn)生活性氧的進發(fā)，隨后在11h后NO濃度達到高峰，PAL酶活與LOX酶活分別在16h和20h達到最大值，說明活性氧、NO、PAL和LOX都參與了細(xì)胞對機械環(huán)境的應(yīng)答。與1

5、.5mm鼓泡孔徑的反應(yīng)器相比，1.0mm鼓泡孔徑反應(yīng)器中細(xì)胞在活性氧、NO、PAL酶活以及LOX酶活水平都高，說明細(xì)胞在小鼓泡孔徑引起的剪切環(huán)境脅迫下的防御應(yīng)答反應(yīng)更為明顯。
　　 運用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC/ESI-MS)，分析了1.0mm和1.5mm鼓泡孔徑的反應(yīng)器與搖瓶培養(yǎng)的紅豆杉細(xì)胞在磷脂代謝水平上的差異。對提取的33個磷脂樣本進行了主成分分析，發(fā)現(xiàn)搖瓶培養(yǎng)與鼓泡塔反應(yīng)器培養(yǎng)48h的細(xì)胞可由第一主成分和第二主成分進行很好的聚