甘草細(xì)胞生物反應(yīng)器連續(xù)培養(yǎng)的研究.pdf

1、甘草在世界藥用歷史悠久，在中國(guó)中醫(yī)理論系統(tǒng)里更是占據(jù)著重要地位。 目前，甘草面臨嚴(yán)重的資源問題，利用植物組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)等現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)甘草等藥用植物進(jìn)行研究迫在眉睫。而用生物反應(yīng)器進(jìn)行藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物也顯示出大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的巨大潛力。 本文在前人的基礎(chǔ)上研究改進(jìn)設(shè)計(jì)了一套用于藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)。在對(duì)這套連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行了細(xì)胞截留效率、沉降效率以及氧傳質(zhì)系數(shù)等主要指標(biāo)的測(cè)試后，對(duì)該

2、生物反應(yīng)器系統(tǒng)的性能有了較為全面的描述。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了脹果甘草愈傷組織誘導(dǎo)和懸浮細(xì)胞系的建立及培養(yǎng)，并對(duì)甘草細(xì)胞進(jìn)行了搖瓶培養(yǎng)，生物反應(yīng)器分批式培養(yǎng)以及生物反應(yīng)器連續(xù)灌注式培養(yǎng)三種不同方式的培養(yǎng)。 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脹果甘草誘導(dǎo)愈傷組織的最優(yōu)外植體為下胚軸，適宜培養(yǎng)基：MS+BA1.0mg/L+2，4-D2.0mg/L，甘草細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基初始培養(yǎng)基為：MS+BA2.0mg/L+NAA0.4mg/L+IAA0.4mg/L+蔗糖30g/L。并在

3、此培養(yǎng)基里添加30g/L的檸檬酸，初步解決了甘草細(xì)胞培養(yǎng)中常出現(xiàn)的細(xì)胞褐化問題，添加500mg/L的水解酪蛋白，發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯作用。 對(duì)比三種培養(yǎng)方式，并分別測(cè)定了各培養(yǎng)過程中的細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線，營(yíng)養(yǎng)消耗動(dòng)力學(xué)曲線等，結(jié)果搖瓶培養(yǎng)遲滯期6天，10～20天為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，25天以后進(jìn)入穩(wěn)定期。 在整個(gè)生長(zhǎng)過程中最高生長(zhǎng)量(鮮重)為106.3g/L，是接種量的13倍以上，在培養(yǎng)的后期，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)幾乎全被消耗。

4、甘草細(xì)胞的生物反應(yīng)器培養(yǎng)，生長(zhǎng)停滯或者生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象不明顯，從培養(yǎng)的4～6d開始，就進(jìn)入了指數(shù)生長(zhǎng)期。 生物反應(yīng)器分批式培養(yǎng)在培養(yǎng)21d的時(shí)候達(dá)到最大生物量，鮮重和干重分別為191.3g/L和15.8 g/L。 生長(zhǎng)速率和比生長(zhǎng)速率分別在第15d和12d達(dá)到最大。但是從培養(yǎng)的18d開始，由于培養(yǎng)液里營(yíng)養(yǎng)的消耗，細(xì)胞生物量和有毒物質(zhì)的積累，細(xì)胞生長(zhǎng)減緩，細(xì)胞生長(zhǎng)速率和比生長(zhǎng)速率也出現(xiàn)小于0。 而生物反應(yīng)器連續(xù)培養(yǎng)與分

5、批培養(yǎng)方式相比，不僅鮮重和干重分別達(dá)到了288.5g/L和18.4g/L。而且由于連續(xù)的營(yíng)養(yǎng)供給和廢液排出，細(xì)胞生長(zhǎng)受到的反饋抑制作用的現(xiàn)象得到明顯改善，細(xì)胞生長(zhǎng)速率沒用明顯減緩。 細(xì)胞生長(zhǎng)的最高生長(zhǎng)速率和比生長(zhǎng)速率出現(xiàn)在培養(yǎng)的第12d和9d，而且到培養(yǎng)的第21d以后生長(zhǎng)速率和比生長(zhǎng)速率基本趨于平穩(wěn)，沒有出現(xiàn)小于0的現(xiàn)象。而且，在三種培養(yǎng)方式的最高生長(zhǎng)速率比較來看，連續(xù)灌注培養(yǎng)高于分批培養(yǎng)20個(gè)百分點(diǎn)，高于搖瓶培養(yǎng)33個(gè)百分點(diǎn)。