豬細小病毒分子流行病學調查以及PPV3VP2蛋白免疫特性的研究.pdf

1、豬細小病毒1型(Porcine parvovirus1，PPV1)可導致母豬繁殖功能性障礙，給全球的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經濟損失。近年來國內外陸續(xù)報道出多種新型的豬細小病毒，其中包括豬細小病毒2型(Porcine parvovirus2，PPV2)、豬細小病毒3型(Porcineparvovirus3，PPV3)、豬細小病毒4型(Porcine parvovirus4，PPV4)、豬類博卡病毒(Porcine boca-like viru

2、s，PBo-likeV)和豬博卡病毒(Porcine bocavirus，PBoV)等。本研究同時對上述五種新型豬細小病毒在國內的流行概況和變異程度進行了調研，豐富了其分子流行病學參考資料;利用大腸桿菌表達系統(tǒng)和昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)同時表達了PPV3VP2完整蛋白和截短蛋白以研究其免疫原性，為PPV3亞單位疫苗的研發(fā)奠定了理論基礎;利用PPV3重組VP2蛋白pET-28a-540建立了間接ELISA方法，為PPV3的檢測提供了血清學檢測手段

3、。具體研究內容如下:
　　1.新型豬細小病毒的分子流行病學調查
　　本研究對2008～2013年期間的308份送檢病料進行了PCR檢測，結果顯示PPV2、PPV3、PPV4、PBo-likeV和PBoV的檢出率依次為46.4％、21.1％、6.8％、12.3％和5.5％。結合同批病料的PRRSV和PCV2檢測結果進行初步分析，結果顯示PPV3和PRRSV混合感染的幾率為43.1％(28/65)，PBo-likeV和PCV2混

4、合感染的幾率為78.9％(30/38)，提示它們在感染過程中可能存在著協(xié)同作用。比對測序結果并繪制截短結構基因的進化樹，顯示PPV3、PPV4和PBo-likeV的序列高度保守，而PPV2和PBoV的序列則有較大幅度的變異。
　　2.豬細小病毒3型結構蛋白的原核表達與免疫特性研究
　　本研究將不同大小的PPV3 VP2基因克隆入原核表達載體pET-28a，利用E.coliBL21分別表達重組蛋白pET-28a-540、pET

5、-28a-555和pET-28a-VP2，SDS-PAGE結果顯示三種蛋白均能正常表達且以包涵體的形式存在，利用包涵體洗液純化得到了高純度的重組蛋白，其中以蛋白pET-28a-540的純度最高。為研究其免疫原性，利用弗氏佐劑將三種蛋白分別制成亞單位疫苗，依次命名為Sub-28a-540、Sub-28a-555和Sub-28a-VP2。小鼠免疫試驗顯示，免疫Sub-28a-VP2的小鼠抗體效價顯著性高于(P＜0.05)免疫Sub-28a-

6、555的小鼠，而免疫Sub-28a-540的小鼠抗體效價居中。
　　3.豬細小病毒3型結構蛋白的真核表達與免疫特性研究
　　本研究將不同大小的PPV3 VP2基因克隆入真核表達載體pFastBacDual，構建了重組桿狀病毒pFastBacDual-540、pFastBacDual-555和pFastBacDual-VP2，經SDS-PAGE和Western blot鑒定，三種VP2基因均能在重組病毒中表達。為進一步研究三種

7、蛋白的免疫原性，大量增殖病毒pFastBacDual-555和pFastBacDual-VP2后進行蛋白純化，將純化的蛋白分別制成亞單位疫苗并免疫小鼠。免疫后不同時間采血，測定抗體滴度和細胞因子濃度:間接ELISA檢測結果表明，兩組疫苗均能誘導機體產生較高水平的特異性抗體;夾心ELISA檢測結果表明，免疫蛋白pFastBacDual-VP2的小鼠體內IL-4和IFN-γ的濃度均顯著性升高(P＜0.05)。結果顯示蛋白pFastBacDu

8、al-VP2可以同時誘導機體產生體液免疫應答和細胞免疫應答。
　　4.豬細小病毒3型問接ELISA抗體檢測方法的建立和應用
　　本研究以純化的重組蛋白pET-28a-540作為包被抗原，利用方陣滴定法建立了PPV3間接ELISA抗體檢測方法。確立的反應條件為:最佳抗原包被濃度為0.5μg/m，最佳血清稀釋度為1∶100，最佳抗原包被條件為37℃1h，最佳封閉液為含5％脫脂奶粉的PBST，最佳封閉條件為37℃2h，血清最佳反應

9、條件為37℃1h，HRP-SPA的最佳稀釋度和最佳反應條件分別為1∶20000和37℃30min，TMB最佳反應條件為37℃避光作用6min。依據(jù)統(tǒng)計學方法確立了陰陽性血清的判定標準:P/N＞2.1且OD450nm≥0.318的為陽性，OD450nm＜0.277的為陰性，0.318＞OD450nm＞0.277的為可疑。特異性試驗表明該抗原與CSFV、FMDV、PCV2、PRV、PRRSV標準陽性血清無交叉反應，顯示出高度的特異性;批內和