犬細小病毒流行病學調(diào)查及其感染F81細胞的比較蛋白質(zhì)組學分析.pdf

1、犬細小病毒（Canine Parvovirus，CPV）是最常見的犬的致死性病毒之一。CPV在世界范圍內(nèi)流行，變異率很高，但是該病沒有有效治療方法，主要通過疫苗免疫進行預(yù)防。為了監(jiān)測我國東北部地區(qū)的CPV變異情況，更好的預(yù)防CPV感染，從哈爾濱、長春、沈陽、保定、青島收集216份臨床病料，測序獲得64株VP2全長序列，包含40株CPV-2a型，23株CPV-2b型和1株CPV-2c型毒株。調(diào)查結(jié)果顯示，保定地區(qū)主要流行CPV-2b型毒株

2、，其它4個地區(qū)主要流行CPV-2a型毒株，CPV-2c型首次在青島地區(qū)得到檢測。突變位點分析表明，本實驗中100％的毒株序列在297和324位氨基酸殘基分別發(fā)生Ser-Ala和Ile-Arg的突變。我們檢測到5株病毒存在Gln370Arg突變，以往這種突變僅在熊貓的CPV分離株中發(fā)現(xiàn)，該突變可能會影響CPV的宿主范圍。選擇壓力預(yù)測發(fā)現(xiàn)突變Phe267Tyr，Ser297Ala，Thr324Ile和Thr440Ala均在正向選擇壓力下。M

3、L進化樹顯示，中國與其他國家流行的CPV-2c型毒株存在顯著地域差異。MCC樹預(yù)測發(fā)現(xiàn)，東北部地區(qū)當前流行的64個毒株都在同一進化分支上，它們最近的共同祖先出現(xiàn)在1996年。值得注意的是，這次流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)以 CPV-HLJ-6為代表18株 CPV-2a序列完全一致，表明該毒株為東北部地區(qū)的優(yōu)勢流行毒株，我們推測當前使用的疫苗不能對該優(yōu)勢毒株產(chǎn)生足夠的免疫效力。
　　為了揭示CPV流行毒株與疫苗毒株之間的差異，我們利用iTRAQ

4、結(jié)合納米高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，在優(yōu)勢流行毒株CPV-HLJ-6和CPV-2型弱毒疫苗毒株感染F81細胞后48 h進行比較蛋白質(zhì)組學分析。鑒定到31個差異表達蛋白，利用David和Panther功能富集分析發(fā)現(xiàn)，差異蛋白涉及31個生物學過程，富集于14個細胞組分，分類于9個分子功能。利用MetaCore進行通路富集分析發(fā)現(xiàn)，差異蛋白顯著富集于血凝、細胞骨架重塑和G蛋白信號相關(guān)信號通路。Ras超家族蛋白質(zhì)、細胞骨架相關(guān)蛋白質(zhì)以及血凝現(xiàn)象

5、相關(guān)蛋白的發(fā)現(xiàn)，有助于從宿主細胞對病毒復(fù)制的影響、細胞致病性、病毒血凝性等方面揭示流行毒株與疫苗毒株之間的差異。
　　CPV流行毒株與疫苗毒株感染細胞的蛋白種類及表達量差異可能是毒株不同導(dǎo)致的，也可能是細胞處于不同感染階段所致。為了在感染后各個階段解析CPV與宿主相互作用關(guān)系，我們對CPV感染F81細胞后的5個時間點進行了比較蛋白質(zhì)組學分析。通過方差分析，篩選到感染后0-60 h存在615個差異蛋白質(zhì)，通過雙尾未配對t檢驗，分別篩

6、選到85、102、95、209和225個細胞蛋白質(zhì)的表達量在CPV感染12 h、24 h、36 h、48 h和60 h有顯著差異。韋恩分析發(fā)現(xiàn)僅有3個差異蛋白質(zhì)共同存在于5個時間點。David功能富集發(fā)現(xiàn)，感染后12 h的差異蛋白主要富集于細胞周期相關(guān)生物學過程，在感染后60 h細胞凋亡相關(guān)差異蛋白種類最多。結(jié)合David及Cluster3.0分析，獲得了大量與細胞凋亡和病毒刺激相關(guān)的蛋白質(zhì)。通過通路富集分析發(fā)現(xiàn)8個與CFTR降解通路相