基于表面等離子體共振原理的病原體快速檢測芯片的研制.pdf

1、目的：構建基于表面等離子體共振(SurfacePlasmonResonance，SPR)原理的病原體快速檢測基因芯片。利用SPR傳感器的快速、敏感、高效、不需標記及純化等特點，建立一套完整的基因芯片系統(tǒng)檢測技術，使之具有設備簡單，靈敏度高，應用范圍廣，技術穩(wěn)定易于掌握等優(yōu)點，達到使基因芯片的檢測技術能更適用于臨床、普通實驗室甚至更復雜環(huán)境的目的。 方法：1.通過查閱文獻報道以及臨床調(diào)查，確定檢測靶病原體。對各靶病原體的特征性核酸

2、標志進行確定以及擴增引物的設計并對擴增條件進行優(yōu)化確定；2.設計各靶病原體特異性寡核苷酸探針，利用生物信息學方法對探針進行計算機模擬篩選；3.在載玻片表面鋪制具有SPR響應的50nm金膜層，并比較了常用兩種不同直徑膠體金溶液金膜鋪制方法的效果；4.利用硫醇化合物表面單分子自組裝層技術(Self-assembledMonolayer，SAM)固定探針，制備具有SPR響應的基因檢測芯片，并對自組裝時間，探針濃度等進行優(yōu)化；5.將篩選出的檢測

3、探針、陽性對照探針以及陰性探針點利用SAM技術制成雜交芯片，利用酶標記化學發(fā)光法對各探針的雜交性能進行檢測；6.利用SPR檢測系統(tǒng)對所構建芯片的檢測性能進行了測試；7.結(jié)合Chelex-100處理臨床樣品進行檢測，與常規(guī)臨床檢測方法比較該芯片的檢測特性。 結(jié)果：1.確定了7種臨床常見的感染病原體及臨床少見但重要的病原體為檢測目標，包括：淋病奈瑟氏菌，人類乳頭瘤病毒(HPV)，金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、奇異變形桿

4、菌、洛菲氏不動桿菌。并完成各靶病原體特征性核酸標志的確定以及擴增引物的設計并對擴增條件進行優(yōu)化確定；2.設計各靶病原體特異性寡核苷酸探針，利用生物信息學方法對探針進行計算機模擬篩選，各探針的G+C含量、發(fā)夾結(jié)構、自身二聚體以及重復堿基數(shù)等指標均符合寡核苷酸探針設計要求，所選用探針特異性強，雜交溫度均＜65℃；3.在載玻片表面鋪制具有SPR響應的50nm金膜層：確定Frens法(檸檬酸鈉還原法)膠體金溶液配制，以及膠體金納米粒子自組裝單層

5、膜為催化模板，氯金酸/羥胺金膜鍍制法金膜鋪制方法。通過比較確定使用2.5nm膠體金法鋪制金膜；4.利用硫醇化合物表面單分子自組裝層技術(SAM)固定探針，制備具有SPR響應的基因檢測芯片，并確定自組裝時間為4.5小時，探針濃度為：1500nmol/L；5.酶標記化學發(fā)光法檢測顯示，相應檢測探針點及陽性對照均有雜交結(jié)果，陰性對照、空白對照和其他探針點均無顯影結(jié)果，背景清晰，結(jié)果可靠。證明所設計的探針準確可靠，可用于各靶序列的檢測；6.實驗

6、結(jié)果顯示，將芯片利用SPR檢測系統(tǒng)檢測，其最低檢測值可達10fmol/L，同目前常用的熒光素cy3為報告分子的方法相比，其靈敏度要高出500倍。雜交時間在16小時可獲得滿意的雜交效果。特異性檢測顯示該芯片特異性強，與更改堿基的探針無雜交；7.臨床樣品檢測結(jié)果顯示，陽性探針點及陽性對照點均有顯影結(jié)果，陰性對照、空白對照和其他探針點均無顯影結(jié)果，結(jié)果可靠。檢測結(jié)果與常規(guī)經(jīng)典檢測鑒定方法結(jié)果一致，證明本檢測方法準確可靠，可用于臨床樣品的檢測。

7、 結(jié)論：基因芯片技術是近年來發(fā)展起來的一項新的核酸檢測實驗技術，具有快速、敏感、高效、高通量等優(yōu)點，已逐漸應用于DNA測序、基因表達譜分析、基因多態(tài)性分析、藥物開發(fā)、基因診斷等多個領域。目前通用的基因芯片技術有多種，但都存在著靈敏度不高，檢測技術復雜，條件和設備要求高等問題，限制了該技術在臨床檢測中的應用。本實驗自行研究構建了基于表面等離子體共振(SPR)原理的病原體快速檢測基因芯片。實驗結(jié)果表明：該芯片檢測技術靈敏度高，特異性