基于細胞芯片的表面等離子體共振成像技術及其在藥物分析中的應用.pdf

1、在化工制藥研究中，利用表面等離子體共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）技術評價候選藥物與其作用靶點的結合性能，進而對其進行篩選是藥物開發(fā)的重要步驟。作為一種光學傳感方法，表面等離子體共振技術具有實時、免標記、高靈敏度等優(yōu)點，但是傳統(tǒng)的SPR應用需要先從細胞內提取、純化目標分子，然后將其固定修飾在傳感芯片表面，操作復雜，耗時費力；此外，離開了細胞環(huán)境，目標分子的化學構象及生物活性都可能發(fā)生改變，影響實驗結果的

2、準確性。因此，本文利用基于細胞芯片的表面等離子體共振成像技術（Surface Plasmon Resonance image，SPRi）原位測量細胞表面的生物化學反應。
　　首先，本文利用基于細胞芯片的SPRi技術研究了免疫熒光試驗中熒光標記分子對細胞表面生物分子結合反應的影響，說明了免標記技術在生物化學研究中的重要性。該章研究使用帶正電、負電及電中性的有機熒光分子標記麥芽凝集素（Wheat Germ Agglutinin，WGA

3、），然后分別測量免標記的WGA以及三種被標記WGA與細胞表面糖蛋白受體分子之間的結合吸附-解離脫附過程，并通過改變溶液離子濃度進一步驗證熒光分子電荷的影響。結果表明：熒光標記分子的電荷性質顯著影響細胞表面配體-受體（Wheat Germ Agglutinin-Glycoprotein）分子之間的結合吸附過程以配體分子在細胞表面結合位點的分布區(qū)域。這種影響主要來源于細胞膜本身所帶負電荷，可以促進被正電荷熒光分子標記的配體分子與細胞表面受體

4、分子快速結合；而細胞膜表面電荷分布不均一，也造成不同熒光分子標記的配體分子在細胞表面結合的分布區(qū)域存在差異。
　　然后，本文通過穩(wěn)定光源溫度和鎖定傳感芯片位置，改善了實驗裝置信噪比，實現(xiàn)了原位監(jiān)測單克隆抗體藥物分子（Herceptin）與細胞表面受體分子（Her2）之間的動態(tài)結合過程，藉此分別測量了Herceptin分子與不同細胞系細胞以及腫瘤組織原代細胞表面 Her2分子之間的鍵合反應。結果表明：不同細胞系細胞表面，甚至同一細胞

5、系不同細胞表面 Herceptin-Her2相互作用的結合動力學常數(shù)有明顯差異，這種差異在腫瘤組織的原代細胞表面表現(xiàn)的更加顯著。從而強調了免標記單細胞研究的結果更加準確可靠。
　　其次，針對在臨床治療過程中，腫瘤細胞會對單克隆抗體藥物分子 Herceptin產生耐藥性的問題，本文測定了在藥物敏感和藥物耐受細胞表面，Herceptin-Her2分子間反應的結合動力學曲線，并通過雙通道熒光染色技術進一步解釋藥物分子在藥物耐受細胞表面結

6、合動力學改變的原因。實驗發(fā)現(xiàn)：由于粘蛋白Muc4的過度表達阻礙了部分 Herceptin-Her分子反應的結合位點，在藥物耐受細胞表面一些Herceptin分子脫附解離速度顯著增大，無法有效作用于腫瘤細胞，導致藥物分子Herceptin的后期治療失敗。
　　最后，本文利用基于細胞芯片的SPRi技術研究了新型靶向納米藥物在細胞表面的結合性能。本章實驗通過Protein A分子的共軛螯合作用，制備了表面修飾不同密度靶向識別分子 Her

7、ceptin的金納米顆粒（AuNP）作為靶向納米藥物（Herceptin@AuNP），再分別測定了上述納米藥物在Her2表達濃度不同的細胞表面的動態(tài)結合過程。實驗發(fā)現(xiàn)：靶向納米藥物（Herceptin@AuNP）表面的識別分子（Herceptin）密度以及細胞表面目標受體分子（Her2）的表達濃度都會顯著影響靶向納米顆粒在細胞表面的結合方式。納米顆粒（AuNP）會影響識別分子（Herceptin）與受體分子（Her2）之間的結合性能，靶

8、向納米藥物只有與受體分子（Her2）之間發(fā)生雙（多）鍵合反應才能有效結合在細胞表面。
　　上述結論完善了基于細胞芯片的SPRi技術，拓寬了該技術的應用范圍，強調了免標記單細胞分析在生物檢測及藥物分析中的必要性和可靠性；同時也揭示了電荷對細胞表面生物化學反應的影響、闡明了腫瘤細胞對單克隆抗體藥物產生耐藥性的動力學機制、發(fā)現(xiàn)了影響靶向納米顆粒在細胞表面結合性能的主要因素。這些都有助于人類進一步理解生化反應的本質、加快新型藥物開發(fā)進度、