體外持續(xù)傳代對人胎兒來源干細胞生物學特性影響的研究.pdf

1、目的:研究體外持續(xù)傳代對兩種人胎兒來源干細胞（臍帶間充質(zhì)干細胞和羊膜上皮細胞）基本特性、致瘤性及干性等生物學特性的影響，為干細胞的質(zhì)量監(jiān)控提供實驗依據(jù)。
　　方法:使用相同方法分離獲得的原代臍帶間充質(zhì)干細胞(n=3)和羊膜上皮細胞(n=8)進行持續(xù)傳代培養(yǎng)，研究第7、14和21代臍帶間充質(zhì)干細胞基本特性（形態(tài)、增殖、細胞周期、凋亡和衰老）、致瘤性（染色體數(shù)量和致瘤基因表達）以及干性（表型、干性基因表達、心肌、神經(jīng)和肝分化能力）的差

2、別，并探討原代羊膜上皮細胞干性標志物SSEA-4的表達水平與體外培養(yǎng)后細胞表型以及分化能力變化的關(guān)聯(lián)性。
　　結(jié)果:
　　1.持續(xù)傳代對臍帶間充質(zhì)干細胞生物學特性的影響
　　1)持續(xù)傳代對臍帶間充質(zhì)干細胞基本特性的作用規(guī)律
　　初代的臍帶間充質(zhì)干細胞呈長梭形，隨著傳代次數(shù)的增加，部分細胞變得寬大，細胞增殖速率下降，出現(xiàn)了S和G2期阻滯現(xiàn)象，但三個代數(shù)細胞間無統(tǒng)計學差異。此外，三個代數(shù)細胞均未發(fā)生明顯凋亡:活細胞（

3、Annexin(V)-/PI-細胞）比例均超過90％，無統(tǒng)計學差異。然而，與第7代及第14代相比，第21代衰老細胞比例顯著增高(P7:0.032±0.018;P14:0.062±0.038;P21:0.229±0.019)。衰老相關(guān)的P21基因表達也顯著升高(P21:0.050±0.020, P14:0.007±0.001, P7:0.010±0.004)(P＜0.05)。上述實驗結(jié)果表明，第14代以內(nèi)的臍帶間充質(zhì)干細胞能夠較好地保持其

4、基本特性，而第21代細胞則出現(xiàn)了明顯衰老。
　　2)持續(xù)傳代對臍帶間充質(zhì)干細胞致瘤性的作用規(guī)律
　　三個代數(shù)細胞染色體數(shù)量未發(fā)生變化，癌基因E-Ras的表達無統(tǒng)計學差異。然而，第21代癌基因c-Myc(0.047±0.005)的表達則顯著高于第7(0.014±0.006)和14代(0.011±0.002)(P＜0.05)。這些結(jié)果表明，盡管第21代細胞染色體數(shù)量正常，但癌基因的表達會出現(xiàn)明顯上調(diào)，提示高代數(shù)細胞可能具有較高的

5、致瘤性。
　　由于第21代細胞衰老和癌基因表達均顯著升高，因此在之后的干性研究中只選擇使用第7和第14細胞。
　　3)持續(xù)傳代對臍帶間充質(zhì)干細胞干性的作用規(guī)律
　　三個代數(shù)細胞的間充質(zhì)干細胞典型的表面標志物(CD73、CD90和CD105)表達均高于99％，不表達造血干細胞標記物HLA-DR和CD45，各代數(shù)無統(tǒng)計學差異。與第7代細胞相比，第14代細胞的干性基因Oct3/4(P7:2.378E-5±1.347E-5,

6、P14:1.955E-5±3.692E-6)、Nanog(P7:1.063E-5±5.722E-6, P14:6.517E-6±2.666E-6)、Vimentin(P7:0.507±0.144，P14:0.323±0.041)，外胚層祖細胞標志物Nestin(P7:9.421E-4±2.011E-4，P14:6.952E-4±2.906E-4)和中胚層祖細胞標志物GATA4（P7:3.215E-5±3.716E-5，P14:5.082

7、E-6±5.293E-6）的表達有下調(diào)趨勢，內(nèi)胚層祖細胞標志物AFP(P7:5.891E-5±2.439E-5，P14:9.916E-5±2.620E-5)有上調(diào)趨勢，但無統(tǒng)計學差異。另外，心肌誘導分化實驗結(jié)果顯示:第7代細胞的心肌標志物α-actinin的蛋白表達(0.111±0.030)顯著高于第14代(0.033±0.006)細胞(P＜0.05)，這說明第7代細胞具有較高的心肌分化能力。神經(jīng)誘導分化實驗結(jié)果則顯示:第14代細胞中N

8、estin(27.2±12.0％)、β-tubulinⅢ(70.4±4.5％)陽性細胞的比例較之第7代(Nestin:20.9±0.8％;β-tubulinⅢ:38.6±10.2％)細胞表達升高，β-tubulinⅢ有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，Nestin無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，這說明第14代細胞具有較高的神經(jīng)分化能力。此外，早期肝誘導分化實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第7代細胞的肝功能標志物Albumin的基因(P7:16.433±12.92

9、1，P14.12.967±1.358)(P＜0.05)及蛋白表達(P7:0.382±0.270，P14:0.260±0.127)有高于P14代的趨勢，但無統(tǒng)計學差異，提示第7代細胞可能具有較高的肝分化潛能，但受到個體差異的影響。
　　2.持續(xù)傳代對羊膜上皮細胞生物學特性的影響
　　流式細胞儀分析表明，不同樣本來源的原代羊膜上皮細胞干性標志物SSEA-4的表達在26.7％-97％之間，存在很大的個體差異。第2代細胞與原代細胞相

10、比，SSEA-4表達水平明顯降低，其下降程度與原代細胞SSEA-4的表達水平無關(guān)。另外，傳代培養(yǎng)后羊膜上皮細胞的心肌分化潛能也存在很大個體差異，且其差異與原代細胞SSEA-4表達水平的高低無關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.第14代之內(nèi)的臍帶間充質(zhì)干細胞較好地保持了其基本特性，未發(fā)生明顯衰老，且具有較低的癌基因表達，因此更適合再生醫(yī)學研究與應(yīng)用。
　　2.臍帶間充質(zhì)干細胞分化實驗表明，盡管受到個體差異的影響，但是體外持續(xù)傳代對

11、不同分化方向有不同的作用規(guī)律，較低代數(shù)細胞的心肌及肝分化能力可能較高，而較高代數(shù)細胞的神經(jīng)分化能力可能較強，因此在具體應(yīng)用中需要考慮體外傳代對臍帶間充質(zhì)干細胞具體分化方向及能力的影響，盡可能選擇適合代數(shù)的細胞，同時加強干細胞的質(zhì)量監(jiān)控，以提高安全性和有效性。
　　3.不同樣本來源的原代羊膜上皮細胞的SSEA-4表達水平受到個體差異的影響，需要建立更準確的臨床樣本篩選指標來穩(wěn)定獲得原代高表達SSEA-4的胎兒樣本，以實現(xiàn)對羊膜上皮細