人表皮干細(xì)胞及眼瞼鱗癌腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性的研究.pdf

1、胚胎的分化發(fā)育研究顯示人體內(nèi)存在干細(xì)胞，包括胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。這種細(xì)胞的存在，使得在遺傳性或嚴(yán)重外傷性疾病中人體器官或組織的再生成為可能?，F(xiàn)階段研究表明人表皮干細(xì)胞(Epidermal stem cells，ESC)主要存在于皮膚毛囊外根鞘和表皮基底細(xì)胞層中。 近年來，隨著正常干細(xì)胞研究理論的深入和研究技術(shù)的發(fā)展，許多學(xué)者提出腫瘤干細(xì)胞(Tumor stem cells，TSC)的概念，認(rèn)為腫瘤是由腫瘤干細(xì)胞增殖分化形成，

2、而腫瘤干細(xì)胞起源于正常干細(xì)胞的突變。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織內(nèi)具有無限增殖、分化和克隆能力的一小部分細(xì)胞，該細(xì)胞移植到體內(nèi)后可以形成原發(fā)腫瘤。這部分細(xì)胞與正常干細(xì)胞一樣，都具有慢周期性和無限增殖的能力。腫瘤干細(xì)胞的研究將更新人們對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的認(rèn)識(shí)，為目前研究腫瘤的形成提供了新的思路，為治療腫瘤提供了新方法。 一、研究目的：本研究以人胚胎表皮和眼瞼鱗狀細(xì)胞癌為研究對(duì)象，通過觀察人胚胎表皮的發(fā)育過程，研究人胚胎表皮干細(xì)胞的分布

3、及生物學(xué)特性；探討表皮鱗狀細(xì)胞癌組織中是否存在腫瘤干細(xì)胞并研究其生物學(xué)特性；初步比較表皮干細(xì)胞和相關(guān)惡性腫瘤干細(xì)胞的異同。這些研究為新的腫瘤發(fā)生機(jī)制提供了理論依據(jù)，并為表皮惡性腫瘤的靶向治療打下了基礎(chǔ)。 二、實(shí)驗(yàn)方法： 實(shí)驗(yàn)材料的收集：胚胎組織取自中山大學(xué)第三附屬醫(yī)院合法流產(chǎn)胎兒，胚齡從8W～38W不等。眼瞼鱗狀細(xì)胞癌取自2005年7月～2006年6月期間在中山眼科中心四區(qū)接受手術(shù)的患者，病理診斷由本中心病理室作出。SU

4、NE1鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系由中山大學(xué)腫瘤防治中心友情提供。 1 取不同胚齡胚胎全身不同部位皮膚標(biāo)本，作形態(tài)學(xué)觀察和免疫組織化學(xué)鑒定。 取不同胚齡人皮膚標(biāo)本，用10﹪福爾馬林溶液固定，石蠟包埋、切片，每片5μm，HE染色及免疫組化染色。第一抗體有P63， K19，CKAE1/AE3；以PBS替代一抗為陰性對(duì)照； 2 取新鮮胚胎皮膚組織進(jìn)行表皮細(xì)胞體外培養(yǎng)及免疫組化鑒定新鮮胚胎皮膚組織經(jīng)含雙抗的PBS液沖洗后，采用組織塊

5、培養(yǎng)法進(jìn)行人胚胎表皮細(xì)胞原代培養(yǎng)，并作原代細(xì)胞的免疫組化鑒定。 3 人眼瞼皮膚鱗狀細(xì)胞癌形態(tài)學(xué)觀察及免疫組化鑒定； 取人眼瞼皮膚鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本，用10﹪福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，切片，每片5μm，HE染色及免疫組化染色(第一抗體為P63)。 4 人眼瞼皮膚鱗狀細(xì)胞癌體外培養(yǎng)及免疫組化鑒定取新鮮人眼瞼皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織，經(jīng)含雙抗的PBS液沖洗后，采用組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行癌細(xì)胞體外培養(yǎng)，并作原代細(xì)胞的免疫組化鑒定。

6、 5 SIYNE1鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系體外細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)SLYNE1鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系由中山大學(xué)腫瘤防治中心提供。復(fù)蘇SUNE1細(xì)胞，按20個(gè)/ml，50個(gè)/ml，100個(gè)/ml的細(xì)胞濃度，在10mm直徑細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞克隆。14天后細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼蘭染色，記數(shù)克隆率。觀察形成的克隆大小，并對(duì)克隆分類。 6 SLINE1鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系亞細(xì)胞群比率流式檢測(cè)復(fù)蘇SUNE1細(xì)胞。按5×10<'6>細(xì)胞濃度，依次用1﹪多聚甲醛固定細(xì)胞，破

7、膜劑破膜，PE標(biāo)記的P63抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光染色。流式細(xì)胞儀檢測(cè)陽性細(xì)胞比率。 7 半定量RT-PCR．法檢測(cè)SUNE1細(xì)胞中表皮發(fā)育基因表達(dá)提取SUNE1細(xì)胞總RNA，RT-PCR法檢測(cè)總RNA中表皮發(fā)育基因P63，PCNA，K1，β1-integrin，K15的表達(dá)情況；β-actin作內(nèi)參。 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1．人胚胎表皮形態(tài)學(xué)及免疫組化研究9W人胚胎表皮標(biāo)本僅見兩層細(xì)胞，深層為立方形的基底細(xì)胞，外層為扁平的

8、周皮細(xì)胞。胚齡大于10W的標(biāo)本見基底層細(xì)胞開始分裂，依次向外長(zhǎng)出棘層，顆粒層，透明層和角質(zhì)層細(xì)胞；同時(shí)，毛發(fā)開始出現(xiàn)。9W左右的標(biāo)本P63染色僅見基底細(xì)胞層部分細(xì)胞陽性，而10W后，P63染色可見不僅基底細(xì)胞層部分細(xì)胞，毛囊外根鞘隆突部位部分細(xì)胞均顯示陽性。小于10W的標(biāo)本，干細(xì)胞只存在于基底細(xì)胞層，而10W后的標(biāo)本，干細(xì)胞存在于基底細(xì)胞層和毛囊外根鞘兩個(gè)部位。K19染色可見表皮多層細(xì)胞彌漫性陽性，因此可證明K19不適合做為表皮干細(xì)胞特

9、異性的標(biāo)記物。CKAE1/AE3染色在表皮多層細(xì)胞中均呈陽性，提示這些細(xì)胞均已向角質(zhì)細(xì)胞分化。 2．人胚胎表皮細(xì)胞體外培養(yǎng)干細(xì)胞研究原代細(xì)胞成多邊型或不規(guī)則型，P63染色見陽性細(xì)胞散在分布，取倒置顯微鏡下一個(gè)高倍鏡(200×)視野中陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比率(重復(fù)三次)，約為15﹪左右，即認(rèn)為在表皮細(xì)胞原代培養(yǎng)中，干細(xì)胞約占15﹪。 3．人眼瞼鱗狀細(xì)胞癌形態(tài)學(xué)及免疫組化研究癌細(xì)胞向下生長(zhǎng)至真皮內(nèi)，呈現(xiàn)不規(guī)則的上皮細(xì)胞團(tuán)塊。

10、細(xì)胞較大，胞漿豐富，部分細(xì)胞呈空泡狀?？梢姾朔至严?。P63染色可見較多的胞核強(qiáng)陽性細(xì)胞，提示腫瘤增殖能力旺盛。 4．人眼瞼鱗狀細(xì)胞癌體外原代培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察及免疫組化研究原代細(xì)胞可見細(xì)胞較大，多呈不規(guī)則型。細(xì)胞核分裂像多見。P63染色見大部分細(xì)胞胞核陽性，高倍鏡(200×)視野下陽性細(xì)胞率可高達(dá)50﹪以上。 5．S15NE1細(xì)胞體外克隆實(shí)驗(yàn)研究分別計(jì)算細(xì)胞濃度為20個(gè)/ml，50個(gè)/ml及100個(gè)/ml下SUNE1細(xì)胞的克

11、隆率，均可達(dá)到50﹪左右。根據(jù)克隆形成面積大小，可初步將克隆分為大克隆和小克隆。分別做大、小克隆的P63免疫組化鑒定，可見大、小克隆大部分細(xì)胞均成陽性染色。 6．流式細(xì)胞儀檢測(cè)SUNE1細(xì)胞亞群比率P63陽性細(xì)胞群約占9.8﹪。 7．半定量RT-PCR法檢測(cè)S13NE1細(xì)胞中表皮分化基因的表達(dá)分別檢測(cè)SUNE1細(xì)胞中P63，CK1，CK15，β1-integrin，PCNA等5種常見表皮細(xì)胞分化基因的表達(dá)。可見PCNA表

12、達(dá)最強(qiáng)，CK15次之，P63和β1-integrin表達(dá)較弱，CK1未見表達(dá)表達(dá)。 四、結(jié)論 1．在正常胚胎表皮(包括眼瞼表皮)中有表皮干細(xì)胞的存在。 2．在人眼瞼鱗狀細(xì)胞癌組織中，同樣有干細(xì)胞的存在，即腫瘤干細(xì)胞。 3．正常胚胎表皮原代細(xì)胞培養(yǎng)P63染色陽性率約為15﹪；而人眼瞼鱗癌原代細(xì)胞培養(yǎng)P63染色陽性率高于50﹪。因此表明鱗癌組織中干細(xì)胞含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于正常表皮組織中干細(xì)胞含量。 4．SUN