SCN1A基因剪切突變的功能定量分析：剪切機制以及與癲癇伴熱性驚厥附加癥臨床表型的關(guān)系.pdf

1、目的：
　　編碼I型鈉通道α亞基(Nav1.1)的SCN1A基因突變與熱性驚厥相關(guān)性癲癇關(guān)系最為密切。其中截短突變或錯義突變導(dǎo)致蛋白功能異常的研究相對較多，而剪切位點突變所造成的影響研究甚少。本研究通過對熱性驚厥相關(guān)性癲癇患者SCN1A基因不同剪切位點突變剪切效應(yīng)的分析以及對mRNA轉(zhuǎn)錄本水平的影響，探討剪切突變的位置、剪切模式與表型嚴重程度的關(guān)系。
　　方法：應(yīng)用聚合酶鏈式反應(yīng)擴增(PCR)、變性高效液相色譜分析(DHPL

2、C)和DNA直接測序等方法相結(jié)合，在熱性驚厥相關(guān)性癲癇患者中篩查SCN1A基因所有的外顯子以及與mRNA剪切相關(guān)的內(nèi)含子序列。篩查所得的剪切位點突變和文獻報道的確切剪切位點突變(c.265-1G>A,c.265-3C>A,c.265-3C>T,c.383+1A>G,c.474-13T>A,c.602+5G>A)并納入此項研究。使用體外剪切報告―minigene分析剪切位點突變的剪切效應(yīng)，對那些影響剪切的突變，進一步使用實時熒光定量聚合酶

3、鏈式反應(yīng)(Q-PCR)分析SCN1A基因突變后mRNA轉(zhuǎn)錄本的量。
　　結(jié)果：
　　在我們所有收集的病例組中，一共篩查出6個剪切位點突變：c.602+1G>A,c.3705+1G>T,c.4284+2T>C,c.473+5G>A,c.473+110A>G和c.4853-25T>A。
　　5個位于不變剪切點區(qū)域(-1,-2,+1和+2)的剪切位點存在一種或者2種異常剪切方式：既可以引起完全的相關(guān)外顯子的刪除，也可以是外顯

4、子刪除和的方式，或者引起部分相關(guān)外顯子刪除與異常內(nèi)含子插入相結(jié)合的方式；不變剪切點區(qū)域的突變，可以存在或者不存在正常轉(zhuǎn)錄本，即使存在正常轉(zhuǎn)錄本，其正常剪切轉(zhuǎn)錄本的量也遠遠低于異常剪切轉(zhuǎn)錄本的量，所對應(yīng)的臨床表型是最嚴重的癲癇類型Dravet綜合征(DS)和Lennox-Gastaut綜合征(LGS)。與此相反，2個距離外顯子較遠的深部內(nèi)含子區(qū)域突變c.473+110A>G(有3個病人攜帶此突變)和c.4853-25T>A，只引起內(nèi)含子序

5、列的異常插入；這2個突變均產(chǎn)生2條轉(zhuǎn)錄本，一條正常轉(zhuǎn)錄本和一條異常轉(zhuǎn)錄本，而且正常剪切轉(zhuǎn)錄本的量遠遠高于異常剪切轉(zhuǎn)錄本的量；這兩個突變所對應(yīng)的是臨床表型相對較輕的癲癇：熱性驚厥（FS）、熱性驚厥附加癥（FS+）以及部分性癲癇伴熱性驚厥附加癥(PEFS+)。位于可變剪切位點(或稱潛在剪切位點)(從-14到-3以及+3到+9)區(qū)域的突變對剪切的影響只有一種異常剪切方式：既可以是相關(guān)外顯子的刪除(包括完全外顯子刪除和部分外顯子刪除)，也可以是