遺傳性癲癇伴熱性驚厥附加癥臨床特征、SCN1A基因突變及其電生理特性改變的研究.pdf

1、【研究背景及目的】癲癇是一種由大腦神經元異常放電導致的慢性腦部疾病，具有發(fā)作性、短暫性、刻板性、重復性的臨床特征。研究表明，電壓門控鈉通道是引起諸如神經元這類可興奮性細胞產生動作電位的基本單位。該通道通常是由一個α亞基（形成該通道的核心部分）和兩個小的輔助性β亞基（具有調節(jié)通道的功能）組成的完整膜蛋白。SCN1A基因編碼神經元電壓門控I型鈉離子通道α亞基（Nav1.1），是目前與人類癲癇伴熱性驚厥附加癥（EFS+）最為相關的基因。為了更

2、好的了解攜帶SCN1A遺傳突變的EFS+患者的臨床特征、遺傳特性及其相關的電生理特性改變，特別是攜帶關鍵功能區(qū)的錯義突變但表型較輕的EFS+，其電生理特性的如何改變，有待進一步研究。
　　【研究方法】
　　1、臨床樣本采集。詳細收集熱性驚厥及熱性驚厥附加癥患者臨床資料及血標本。
　　2、SCN1A突變篩查及分析。直接測序和焦磷酸測序進行SCN1A基因點突變和嵌合突變篩查。
　　3、膜片鉗檢測
　?。?）質粒

3、構建及擴增：以含有SCN1A基因的cDNA序列的質粒為模板，設計帶突變點的引物，對發(fā)現(xiàn)的突變點進行質粒構建，成功構建后進行擴增。
　?。?）全細胞膜片鉗記錄：使用全細胞膜片鉗記錄技術以闡述各突變體的生物物理特性，并各自與野生型通道進行比較。觀察的指標有：激活、電流密度、持續(xù)性鈉電流、快速失活、慢速失活、快失活恢復、慢失活恢復等。
　　4、統(tǒng)計學分析：采用SPSS13.0軟件包、Stata10.0和Excel2007進行統(tǒng)計分

4、析，計量資料以均數(shù)±標準誤(-X±SE)表示，組間比較采用兩樣本t檢驗。電生理學結果使用OriginPro8.5軟件擬合和作圖。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　【結果】
　　1、從2007年1月至2014年6月在廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院就診的熱性驚厥及熱性驚厥附加癥患者中發(fā)現(xiàn)14個遺傳突變。其中6例先證者為PEFS+（6/14，43％），4例先證者為GEFS+（4/14，28.6%），3例先證者為SMEB（3/14，

5、21.4%）以及1例先證者為SMEI（1/14，7%）；14例先證者中有11例錯義突變、2例剪接位點突變及1例截短突變。11例錯義突變中有2例表型嚴重（c.337C>A和c.1216G>T），其余為輕表型；2例剪接位點突變中，c.4284+2T>C這個經典剪接位點的突變造成較嚴重的表型；截短突變c.1738C>T造成較嚴重的表型。11個錯義突變中，5個位于NaV1.1通道的關鍵功能區(qū)即電壓感受區(qū)和孔區(qū)（5/11,45.5%），其中4個位

6、于孔區(qū)（4/11,36.4%），1個位于電壓感受區(qū)（1/11,9.1%））；位于關鍵功能區(qū)的5個錯義突變中，除c.1216G>T導致表型嚴重外，其余4個表型較輕。
　　2、輕型表型的先證者中有2例(c.4847 T>C和c.5768 A>G)是來自攜帶該突變的嵌合體親本（2/10,20%），重表型的先證者中有3例(c.337C>A、c.1216G>T及c.1738C>T)來自攜帶該突變的嵌合體親本（3/4,75%）。
　　3

7、、通過酶切和測序證實，成功構建了pCMV-SCN1A-2576，pCMV-SCN1A-2947及pCMV-SCN1A-5132三個關鍵功能區(qū)（即電壓感受區(qū)和孔區(qū)）錯義突變的質粒。
　　4、所有突變體表現(xiàn)出可測量的鈉電流，與野生型相比較，每個突變體呈現(xiàn)了不同的生物物理特性。其中R859H電流密度較野生型增加，功能缺陷表現(xiàn)為鈉通道部分功能增強（GOF）；V983I和G1711D電流密度較野生型減小，且 V983I半數(shù)慢失活向去極化方向