K6W泛素抑制兔后發(fā)性白內(nèi)障.pdf

1、第一部分：重組負(fù)顯性K6W泛素腺病毒顆粒擴(kuò)增純化及滴度檢測(cè)目的：利用QBI-HEK 293A細(xì)胞擴(kuò)增重組負(fù)顯性K6W泛素腺病毒顆粒(RAd-K6W)、重組負(fù)顯性K6W泛素．綠色熒光蛋白腺病毒顆粒(RAd-K6W／GFP)和野生型腺病毒顆粒，純化并檢測(cè)三者病毒滴度。 方法：利用QBI-HEK 293A細(xì)胞大量擴(kuò)增病毒，待細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病理效應(yīng)(cell pathology effect，CPE)時(shí)收集細(xì)胞，反復(fù)凍融3次取上清。通過(guò)

2、連續(xù)和不連續(xù)氯化銫密度梯度離心去除細(xì)胞污染物和缺陷性病毒再進(jìn)行透析，得到可以用于體內(nèi)的病毒原液并檢測(cè)病毒滴度。 結(jié)果：病毒感染QBI-HEK 293A細(xì)胞出現(xiàn)CPE， RAd-K6W和RAd-K6W／GFP組的細(xì)胞生長(zhǎng)速度和病毒擴(kuò)增速度均慢于空病毒載體組，RAd-K6W、RAd-K6W／GFP和空病毒載體最終滴度分別為1.44×108(ifu)／mL、1.41×108(ifu)／mL和2.07×109(ifu)／mL。

3、結(jié)論：RAd-K6W、RAd-K6W／GFP和空病毒載體均通過(guò)QBI-HEK 293A成功擴(kuò)增，在擴(kuò)增過(guò)程中K6W泛素可能起抑制QBI-HEK 293A增殖的作用。 第二部分：重組負(fù)顯性K6W泛素-GFP腺病毒顆粒轉(zhuǎn)染兔晶狀體上皮細(xì)胞的觀察 目的：建立兔后發(fā)性自內(nèi)障模型，前房注射RAd-K6W／GFP病毒原液后觀察，證明其可以成功轉(zhuǎn)染兔晶狀體上皮細(xì)胞并確定注射用量。 方法：取4只新西蘭家兔行右眼超聲乳化晶狀體吸除

4、術(shù)，術(shù)后切口水密縫合，前房分別注射含1uL、2uL、4uL、8 uL RAd-K6W／GFP病毒原液的稀釋液0.5mL，48h后處死，分離囊膜在共聚焦顯微鏡下觀察GFP表達(dá)。3只新西蘭家兔術(shù)后前房注射含8uL RAd-K6W／GFP病毒原液病毒原液的稀釋液0.5mL,分別在術(shù)后48h、7d、19d觀察GFP表達(dá)情況。1只新西蘭家兔術(shù)后雙眼前房注射同等量RAd-K6W和空病毒載體，48h后分離囊袋用免疫印記法檢測(cè)泛素表達(dá)量。 結(jié)果

5、：前房注射48h后，GFP即明顯表達(dá)，泛素表達(dá)量也明顯上調(diào)。轉(zhuǎn)染效率隨病毒量增加而升高，8uL組轉(zhuǎn)染效率約為90％～95％。RAd-K6W／GFP攜帶的GPF表達(dá)隨時(shí)間改變：病毒前房注射48h后即表達(dá)明顯；7d后大部分細(xì)胞表達(dá)GFP；19d后表達(dá)幾乎消失。 結(jié)論：RAd-K6W／GFP可成功轉(zhuǎn)染兔后發(fā)性白內(nèi)障模型的晶狀體上皮細(xì)胞，腺病毒攜帶的外源性基因只表達(dá)1～2w。 第三部分：K6W泛素對(duì)兔后發(fā)性白內(nèi)障的影響

6、目的：形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)RAd-K6W對(duì)兔后發(fā)性白內(nèi)障的影響。 方法：新西蘭家兔24只隨機(jī)分為4組，行雙眼晶狀體超聲乳化吸除術(shù)，前房分別注射不同液量的RAd-K6W和空病毒載體稀釋液0.5mL。另取2只術(shù)后注射世可平衡液作為空白對(duì)照。術(shù)后1d、3d、5d、7d、13d、15d散瞳后用裂隙燈拍照系統(tǒng)拍攝后囊膜渾濁情況，并采用POCOman軟件進(jìn)行半定量分析，并用非接觸式眼壓計(jì)檢測(cè)眼壓、評(píng)價(jià)角膜渾濁程度。 結(jié)果：第一組雙眼PCO評(píng)分

7、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；第二組術(shù)后1d、3d、5d、7d雙眼PCO評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，11d、15d有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；第三組術(shù)后1d、3d雙眼PCO評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，5d、7d、11d、15d有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；第四組出現(xiàn)角膜內(nèi)皮水腫，2w后逐漸恢復(fù)透明。角膜渾濁在3d、7d有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。眼壓第3、7d雙眼眼壓有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，K6W組高于對(duì)照組；第1、11、15d雙眼眼壓無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論：達(dá)到適當(dāng)轉(zhuǎn)染效率的RAd-K6W對(duì)兔后發(fā)性白內(nèi)障有抑制作用。

8、過(guò)量表達(dá)K6W泛素可導(dǎo)致角膜內(nèi)皮水腫、眼壓升高的毒性作用。 第四部分：K6W泛素對(duì)兔晶狀體上皮細(xì)胞特征性蛋白表達(dá)的影響 目的：進(jìn)一步觀察RAd-K6W對(duì)兔晶狀體上皮細(xì)胞特征性蛋白表達(dá)的影響。 方法：第三組新西蘭家兔2只術(shù)后15d處死分離囊袋，用免疫印記法檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)；免疫熒光檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。 結(jié)果:RAd-K6W轉(zhuǎn)染15d后增殖的晶狀體上皮細(xì)胞α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)較對(duì)照組