循環(huán)心肌肌鈣蛋白Ⅰ自身抗體檢測(cè)及對(duì)常用肌鈣蛋白Ⅰ檢測(cè)系統(tǒng)負(fù)性干擾評(píng)估.pdf

1、人心肌肌鈣蛋白(Cardiac Troponin)是心肌調(diào)節(jié)蛋白,其亞單位心肌肌鈣蛋白I(cTnl)是具有210個(gè)氨基酸的多肽,相對(duì)分子量為24KD,僅存在于心房肌和心室肌。因cTnl的氨基端較骨骼肌TnI多31個(gè)氨基酸,兩者氨基酸序列的差異達(dá)40％,故具有較好的心肌特異性。心肌發(fā)生損傷時(shí),釋放到人體血液循環(huán)中的cTnI既有游離形式,又有不同復(fù)合物的形式,包括cTnl-C、cTnI-T以及cTnI-ToC等,現(xiàn)已證實(shí)在人體循環(huán)的cTnI

2、中90％以上為cTnI-C二聚體復(fù)合物形式穩(wěn)定存在。 cTnI在心肌損傷時(shí)釋放入血,是心肌損傷敏感而特異的標(biāo)志物,對(duì)于診斷急性冠狀動(dòng)脈綜合癥患者(ACS)心肌缺血及危險(xiǎn)分級(jí)具有重要意義。自1987年Cummins等報(bào)道以血清cTnI對(duì)心肌梗死進(jìn)行診斷以來,cTnI已逐漸取代肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)等心肌酶學(xué)指標(biāo),成為診斷心肌梗死的首要血清標(biāo)志物,cTnI也是獨(dú)立于心電圖(E

3、CG)之外可用于判斷心肌梗死灶范圍大小及預(yù)后的重要血清學(xué)指標(biāo)。同時(shí),cTnI也用于評(píng)判不穩(wěn)定型心絞痛患者罹患心肌梗死和心源性死亡的危險(xiǎn)率,亦是判斷冠心病患者是否應(yīng)接受抗凝藥物,如血小板糖蛋白II b/Ⅲa受體拮抗劑治療的唯一標(biāo)志物。近年來,cTnI已開始為診斷病毒性心肌炎及判斷藥物、大手術(shù)創(chuàng)傷等所致心肌受損的診斷和嚴(yán)重程度等提供幫助。 cTnI檢測(cè)多采用雙抗體夾心法。最初檢測(cè)cTnI的捕獲抗體和標(biāo)記抗體多為多克隆抗體,存在一定的

4、交叉反應(yīng),敏感性較差。隨著cTnI單克隆抗體的使用和檢測(cè)系統(tǒng)的不斷優(yōu)化,cTnI測(cè)定的敏感性和特異性大大提高,目前在國(guó)內(nèi)外被有關(guān)機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于臨床cTnI測(cè)定的檢測(cè)系統(tǒng)已達(dá)十余種。cTnI多肽鏈的大部分序列均具有抗原性,但其氨基末端和羧基末端的抗原性最強(qiáng),從理論上講,cTnI檢測(cè)系統(tǒng)中的檢測(cè)抗體若針對(duì)上述區(qū)域抗原表位,將會(huì)達(dá)到最好的檢測(cè)效果。然而,cTnI分子的氨基末端和羧基末端很容易受到蛋白水解酶水解而降解,無(wú)疑會(huì)直接影響測(cè)定結(jié)果。在c

5、TnI肽鏈中心區(qū)域(第30～110位氨基酸殘基)因受到TnC亞基的保護(hù),穩(wěn)定性明顯提高。因此選用針對(duì)cTnI肽鏈中心區(qū)域的抗體組成的檢測(cè)系統(tǒng),可以較好地消除cTnI分子降解而對(duì)結(jié)果造成的影響。2007年國(guó)際臨床化學(xué)學(xué)會(huì)最新發(fā)布的急性冠脈綜合征和心力衰竭的臨床實(shí)驗(yàn)室診斷指導(dǎo)原則指出,cTnI試劑生產(chǎn)廠家應(yīng)優(yōu)先選擇針對(duì)cTnI中心穩(wěn)定區(qū)域的抗體作為檢測(cè)抗體。然而進(jìn)一步的研究揭示,即使是選擇針對(duì)cTnI中心穩(wěn)定區(qū)域的捕獲抗體和檢測(cè)抗體而建立的

6、檢測(cè)系統(tǒng),也會(huì)受到多種干擾因素的影響使cTnI檢測(cè)值假性升高或降低。由于cTnI在正常人血循環(huán)中濃度非常低,故cTnI檢測(cè)系統(tǒng)的臨床臨界值也比較低,其假陰性或者假陽(yáng)性干擾很容易誤導(dǎo)臨床診斷。鑒于cTnI檢測(cè)在診斷心肌損傷中的重要作用和對(duì)于治療的重要指導(dǎo)作用,充分認(rèn)識(shí)cTnI檢測(cè)中的任何干擾都是十分必要的。研究發(fā)現(xiàn),除了在免疫學(xué)測(cè)定中常見的異嗜性抗體、類風(fēng)濕因子、纖維蛋白原、黃疸、血紅蛋白、抗凝劑等干擾因素外,cTnI自身抗體引起的負(fù)性干

7、擾尤為嚴(yán)重。在生理狀態(tài)下,cTnl為隔絕免疫系統(tǒng)的隱蔽抗原,在某些病理?xiàng)l件下,由于心肌細(xì)胞的損傷和破壞導(dǎo)致cTnI釋放入血,引發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生cTnI自身抗體。1996年Bohner等首次報(bào)道了cTnI檢測(cè)中cTnI自身抗體引起的負(fù)性干擾現(xiàn)象,隨后研究發(fā)現(xiàn)cTnI自身抗體恰好特異性封閉cTnI的第30～110位中心穩(wěn)定氨基酸殘基區(qū)域的抗體結(jié)合位點(diǎn),影響了檢測(cè)抗體與循環(huán)中cTnI結(jié)合而導(dǎo)致其測(cè)定值假性降低。2005年Eriksson等采

8、用回收試驗(yàn)等方法,初步發(fā)現(xiàn)約有3.2％的胸痛患者可能因?yàn)槭艿絚TnI自身抗體的負(fù)性干擾使其血清cTnI檢測(cè)的回收率小于10％。既然血清中cTnI自身抗體對(duì)cTnI的檢測(cè)可以造成如此大的影響,但急性心肌梗死(AMI)或心肌炎等心肌損傷患者血清中cTnI自身抗體陽(yáng)性率到底是多少?cTnI自身抗體滴度與cTnI測(cè)定負(fù)性干擾嚴(yán)重程度是否相關(guān)?其對(duì)當(dāng)前各個(gè)cTnI檢測(cè)系統(tǒng)中的干擾程度究竟如何?本課題旨在給這些疑問尋找答案。本研究結(jié)果對(duì)cTnI檢測(cè)

9、和結(jié)果的臨床應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義,同時(shí)也為cTnI檢測(cè)試劑盒的研發(fā)和改善提供側(cè)重點(diǎn)。 第一部分：人心肌肌鈣蛋白I-C(cTnI-C)融合蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中的可溶性表達(dá)及純化 本部分實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菫榻⒑Y查cTnI自身抗體的EIJSA方法制備包被抗原。根據(jù)心肌損傷患者血清中cTnI主要以cTnI-C復(fù)合物形式存在,且與TnC形成復(fù)合物后穩(wěn)定性增加,不易被蛋白酶水解的特點(diǎn),構(gòu)建cTnI和TnC融合蛋白原核表達(dá)載體。采用硫氰酸

10、胍-酚氯仿一步法提取(TRIzol試劑,美國(guó)GIBCO BRL公司)人心肌組織總RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR,日本TaKaRa公司RT-PCR試劑盒)擴(kuò)增包含cTnI和TnC開放閱讀框的650bp和500bp序列,中間用19個(gè)中性氨基酸為主的短肽將cTnI和TnC連接到一起,構(gòu)建全長(zhǎng)cTnI-C融合蛋白的pET28原核表達(dá)系統(tǒng),在大腸桿菌中進(jìn)行可溶性表達(dá)。目的蛋白氨基端帶有組氨酸“標(biāo)簽”(H

11、is-tag),采用Ni2+金屬螯合親和層析純化。純化產(chǎn)物鑒定結(jié)果:純化產(chǎn)物經(jīng)12％十二烷基磺酸鈉.聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)顯示在相對(duì)分子量為43KD附近有清晰目的蛋白表達(dá)條帶,灰度掃描目的蛋白純度為86.9％。進(jìn)一步使用鼠cTnI單抗(長(zhǎng)海醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科惠贈(zèng))進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析(Western Blot),在相對(duì)分子量為43KD附近顯示單一印跡,無(wú)降解條帶。融合蛋白于-80℃冰箱分裝凍存,實(shí)驗(yàn)過程中采用Access-2(

12、美國(guó)Backman Coulter公司)微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及AccuTnI試劑盒監(jiān)測(cè)cTnI濃度,cTnI-C融合蛋白穩(wěn)定無(wú)降解。 第二部分:建立檢測(cè)人cTnI自身抗體的間接ELISA方法 本部分實(shí)驗(yàn)以第一部分實(shí)驗(yàn)中重組表達(dá)的cTnI-C融合蛋白包被96孔聚苯乙烯板,以鼠抗人cTnI單克隆抗體為一抗確定cTnI-C融合蛋白的包被濃度,初步建立檢測(cè)cTnI抗體的間接ELIA方法。使用該方法對(duì)長(zhǎng)海醫(yī)院80名AMI患者血

13、清進(jìn)行盲篩,從中選出一份在450nm波長(zhǎng)時(shí)吸光度(A450nm)最高的血清,該血清經(jīng)Western Blot鑒定,可與cTnI-C融合蛋白聚丙烯凝膠電泳(PAGE)后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上相對(duì)分子量為43KD的目的蛋白特異結(jié)合,將此血清確定為陽(yáng)性血清。收集長(zhǎng)海醫(yī)院210名健康體檢者血清,做為陰性血清,進(jìn)一步優(yōu)化檢測(cè)cTnI自身抗體的間接ELISA法。 通過棋盤滴定實(shí)驗(yàn),檢測(cè)cTnI自身抗體的間接ELISA法的最佳工作條件為:包被抗

14、原濃度為10μg/L,血清稀釋度為1:50,酶標(biāo)二抗(辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記羊抗人IgG,美國(guó)KPL公司)稀釋度為1:8000。陽(yáng)性血清在450nm處的吸光度(A450nm)均值為1.52。210份陰性血清的A450nm為0.19,SD為0.12,陽(yáng)性臨界值設(shè)定為陰性均值A(chǔ)450nm+3SD,即0.55。 第三部分:AMI和心肌炎患者中cTnI自身抗體陽(yáng)性率的篩查和確認(rèn)收集長(zhǎng)海醫(yī)院心內(nèi)科121名AMI患者血清(既往診斷為冠心病

15、、心絞痛的63名,陳舊性心梗的47名；有心臟手術(shù)史的21名)、24名心肌炎患者(有心肌炎病史的13名,否認(rèn)有心肌炎病史的11名)血清和210名年齡、性別相匹配的健康體檢者血清,采用第二部分實(shí)驗(yàn)中所建立的檢測(cè)cTnI自身抗體的間接ELISA方法進(jìn)行cTnI自身抗體的篩查。ELISA檢測(cè)陽(yáng)性的血清進(jìn)一步采用Western Blot進(jìn)行確證。對(duì)ELISA和Western Blot檢測(cè)均為陽(yáng)性的血清,取其中1份加入不同濃度的cTnI-C融合蛋白

16、,在Access-2上進(jìn)行cTnI劑量依賴實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證cTnI與cTnI自身抗體的結(jié)合特異性。 第四部分:cTnI自身抗體對(duì)常用cTnI檢測(cè)系統(tǒng)負(fù)性干擾評(píng)估 在確證為cTnI自身抗體陽(yáng)性的13份AMI患者血清中加入cTnI終濃度為20μg/L的重組cTnI-C融合蛋白,在上海市5個(gè)主要的cTnI檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行回收試驗(yàn)(2名cTnI自身抗體陽(yáng)性的心肌炎患者分別是3歲和4歲,未能采集足夠的血清進(jìn)行本部分實(shí)驗(yàn))。5家cTnI檢測(cè)

17、系統(tǒng)分別為:Access-2(Backman Coulter),臨床診斷值0.1μg/L;Vidas(Biomerieux),臨床診斷值0.1μg/L;Architect i2000(Abbott),臨床診斷值0.3μg/L;Axsym(Abbott),臨床診斷值2.3μg/L;Dimension X Pand(Dade Behring),臨床診斷值0.15μg/L。設(shè)回收率0～50％為低回收率,50～80％為中等回收率,>80％為正常