15874.人心肌肌鈣蛋白ⅰ及其單克隆抗體的制備

1、分類號：Q789密級：(秘密、機(jī)密、絕密)學(xué)校代碼：10057研究生學(xué)號：11808049人心肌肌鈣蛋白I及其單克隆抗體的制備HumanCardiacTroponinIandPreparationofMonocionalAntibodyagainstcTnI專業(yè)名稱：食品科學(xué)指導(dǎo)教師姓名：汪建明教授研究生姓名：丁祥瑞申請學(xué)位級別：工學(xué)碩士論文提交日期：2013年12月論文課題來源：企業(yè)合作學(xué)位授予單位：天津科技大學(xué)摘要人心肌肌鈣蛋AI(

2、humancardiactroponinI，hcTnI)是臨床檢測心肌損傷及其預(yù)后提供診斷的生物學(xué)指標(biāo)，由于其窗口期長，出現(xiàn)早，故被稱為臨床診斷心肌梗死(AMI)的“金指標(biāo)”。目前臨床使用的檢測cTnI的試劑盒或試紙條，大都來自進(jìn)口或是進(jìn)口原料再組裝的，價格昂貴；此外由于不同的廠家生產(chǎn)，使得檢測結(jié)果存在很大差異。因此，開發(fā)自主研制國產(chǎn)化和標(biāo)準(zhǔn)化的cTnI的檢測產(chǎn)品，十分必要。隨著基因工程的發(fā)展，本研究用基因工程方法構(gòu)建了重組cTnI蛋白

3、原核表達(dá)體系pET11a—cTnI—BL21(DE3)，未加任何其他標(biāo)記標(biāo)簽，使表達(dá)的cTnI蛋白更忠實(shí)于其生物學(xué)特性。利用響應(yīng)曲面法(RSM)優(yōu)化重組表達(dá)蛋白的表達(dá)條件，得到回歸方程預(yù)測cTnI的最佳表達(dá)條件：誘導(dǎo)時機(jī)OD600=10，誘導(dǎo)溫度為300。C，誘導(dǎo)時間為45h，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到優(yōu)化后目的蛋白占總蛋白的表達(dá)比例是3263％，提高了84％。采用Q—SepharoseFF陰離子交換樹脂和PhenylSepharoseFF疏水柱純化

4、，得目的蛋白純度約為72％。純化的樣品行WesternBlot免疫印跡反應(yīng)，結(jié)果顯示在目的條帶位置有明顯反應(yīng)帶，說明純化的目的蛋白cTllI可與cTnI抗體反應(yīng)，有較好的免疫原性。用基因工程方法成功構(gòu)建了重組cTnI蛋白原核表達(dá)體pET28a—cTnI—BL21(DE3)，此重組體系帶有親和性標(biāo)簽六聚組氨酸(6His)，用鎳親和層析柱純化His—cTnI，純度達(dá)到98％，ELISA驗(yàn)證為陽性，可做為檢測蛋白。用純化的cTnI蛋白做為抗原

5、免疫BALB／c小鼠，用高純度的His—cTnI做為間接ELISA法檢測蛋白，Nd鼠免疫效價和篩選陽性克隆，把達(dá)到效價l：50000的小鼠脾臟和骨髓瘤細(xì)胞Sp2／0細(xì)胞融合，制備單克隆抗體。經(jīng)過三次亞克隆和問接ELISA檢測篩選到四株分泌cTnI的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，本實(shí)驗(yàn)分別命名為：B2B4一F12、B2一D2一F6、B2一C2A6、B2G4一E7。挑取B2一D2F6株采用體外細(xì)胞培養(yǎng)法大量制備單克隆抗體，行ProteinASe

6、pharoseCL一4B親和柱層析純化，得到純度90％的抗體，間接ELISA法測其效價1：5000。此抗體行WesternBlot免疫印跡反應(yīng)，結(jié)果顯示在抗原cTnI目的條帶位置有明顯反應(yīng)帶，說明純化的cTnI單克隆抗體可與抗原cTnI反應(yīng)，有較好的免疫原性，即得到了cTnI單克隆抗體。綜上，成功構(gòu)建重組cTnI的表達(dá)菌株，經(jīng)過優(yōu)化表達(dá)條件和相應(yīng)純化獲得較高純度的eTnI和His—cTnI，分別做為抗原和檢測蛋白，并制得多株較好特異性的