大鼠外周血間充質(zhì)干細(xì)胞的富集及生物學(xué)特性研究.pdf

1、目的：探究大鼠外周血間充質(zhì)干細(xì)胞（PBMSC）有效的富集方法，并評(píng)價(jià)其表型特征、生長(zhǎng)曲線、集落形成率以及體外培養(yǎng)向中胚層多系分化能力，為PBMSC作為間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的種子細(xì)胞新來(lái)源用于治療難治性組織損傷性疾病提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：①選用4周齡SD大鼠，按100?g/kg/day的劑量每日一次連續(xù)5天皮下注射粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）進(jìn)行干細(xì)胞動(dòng)員；經(jīng)左心腔采血，用密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞，繼而用貼壁

2、培養(yǎng)法得到成纖維樣集落生長(zhǎng)細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)至第2代，用流式細(xì)胞術(shù)（CD90、CD44、CD29、CD45、CD11b和CD79a）和免疫細(xì)胞化學(xué)染色法（CD73、CD105、CD34和HLA-DR）分析分離、培養(yǎng)的PBMSC的表型特征。②MTS檢測(cè)繪制第2代（P2）PBMSC的生長(zhǎng)曲線，并計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間；采用龍膽紫染色法分析比較 G-CSF動(dòng)員和未動(dòng)員的SD大鼠外周血CFU-F的集落形成率（CFE）。③取生長(zhǎng)良好的P2代PBMSC，用商

3、品化誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)其向成骨、成軟骨以及成脂細(xì)胞分化，于誘導(dǎo)21天后，分別采用茜素紅、阿利新藍(lán)和油紅O染色分析誘導(dǎo)效果。
　　結(jié)果：①外周血單個(gè)核細(xì)胞原代培養(yǎng)至6～7天可見(jiàn)明顯的成纖維樣細(xì)胞的集落樣生長(zhǎng)，培養(yǎng)至21天細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度可達(dá)80％；傳代細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)，形態(tài)均一，呈梭形漩渦狀生長(zhǎng)。②FCM和免疫組化結(jié)果表明，富集的PBMSC高表達(dá)CD90、CD44、CD29、CD73及CD105，不表達(dá)CD45、CD11b、CD79a、CD

4、34和HLA-DR。③生長(zhǎng)曲線顯示，傳代培養(yǎng)的PBMSC增殖能力強(qiáng)，于培養(yǎng)次日即可進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞倍增時(shí)間為39.2 h；CFU-F集落形成率的結(jié)果表明，動(dòng)員后的大鼠 PBMSC的集落形成率為(15.67±2.07)/106，而未動(dòng)員組僅為(0.33±0.58)/106，兩者比較差異顯著（P﹤0.01）。④PBMSC的中胚層系分化能力誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果表明，經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化21天后，茜素紅染色有明顯的鈣結(jié)節(jié)形成；經(jīng)軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化21天后，