衰老的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及基因表達(dá)譜的研究.pdf

1、目的:
　　 1.觀察并檢測人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)衰老過程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)、表型、生長動(dòng)力學(xué)及誘導(dǎo)分化能力等生物學(xué)特性的改變;
　　 2.檢測人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)衰老過程中基因表達(dá)譜的改變并探討其可能的機(jī)制。
　　 方法
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng):用組織塊貼壁法培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，取第3代細(xì)胞作為對(duì)照組，連續(xù)培養(yǎng)到第15代的細(xì)胞為衰老組，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并分別制成細(xì)胞爬片掃描電鏡觀察并拍照。

2、
　　 2.生長增殖:分別取對(duì)照組和衰老組細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板中，各設(shè)8復(fù)孔，培養(yǎng)6天。每日檢測在450nm波長處測吸光值(OD值)，繪制細(xì)胞生長曲線。
　　 3.表型檢測:對(duì)照組和衰老組細(xì)胞消化后充分吹打成單細(xì)胞懸液，使用流式細(xì)胞儀檢測并分析兩組細(xì)胞CD34、CD45、CD44和CD105等表型變化。
　　 4.誘導(dǎo)分化能力鑒定:將對(duì)照組和衰老組細(xì)胞置于不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)液中向成骨細(xì)胞及成脂細(xì)胞誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)分

3、化14天后，進(jìn)行固定，并分別進(jìn)行相應(yīng)的染色觀察誘導(dǎo)分化差異。
　　 5.基因表達(dá)譜分析:細(xì)胞洗滌后加入Trizol試劑，提取總RNA，進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片雜交、檢測和數(shù)據(jù)分析，并用DNA芯片掃描儀行微陣列掃描。將掃描結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析，與對(duì)照組相比|log2Ratio|＞2(4-foldchange)為差異表達(dá)，并進(jìn)行GO及KEGGpathway分析。
　　 6.PCR驗(yàn)證:根據(jù)基因表達(dá)譜的結(jié)果，選取了多個(gè)典型的差異基因進(jìn)

4、行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。檢測對(duì)照組和衰老組細(xì)胞BAX，F(xiàn)ADD，JAK2，IGF3BP5，PDK1，Col-Ⅲ，Col-Ⅳ，SMAD2，SAMD4，BMPR2，CCND2等基因的差異表達(dá)。
　　 結(jié)果
　　 1.細(xì)胞形態(tài):對(duì)照組細(xì)胞呈典型的成纖維狀，每平方毫米可達(dá)500個(gè)細(xì)胞;衰老組細(xì)胞個(gè)體差異較大，細(xì)胞變得寬大，每平方毫米僅有約150個(gè)細(xì)胞，衰老細(xì)胞核質(zhì)比減小。掃描電鏡下可見年輕組細(xì)胞形態(tài)飽滿，表面微絨毛分布均勻，而衰老

5、組細(xì)胞偽足增多，整體扁平。
　　 2.增殖情況:對(duì)照組和衰老組生長曲線在接種后都有一個(gè)停滯期（12-24小時(shí)），然后進(jìn)入增殖期，對(duì)照組細(xì)胞能更快的進(jìn)入增殖期，并在第5天達(dá)到更高的細(xì)胞數(shù)量后進(jìn)入平臺(tái)期。而衰老組停滯期長，進(jìn)入增殖期后第3天進(jìn)入平臺(tái)期，最終的細(xì)胞數(shù)量也少。
　　 3.表型檢測:根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果，對(duì)照組和衰老組細(xì)胞CD34和CD45均為陰性表達(dá)，CD44和CD105均為高表達(dá)，組間陽性率表達(dá)并無顯著差異。

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　　 4.分化能力:在適當(dāng)?shù)姆只瘲l件誘導(dǎo)下，對(duì)照組和衰老組細(xì)胞均能向成骨和脂肪細(xì)胞分化:向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)14天后大部分細(xì)胞出現(xiàn)鈣化胞外基質(zhì)，茜素紅S染色陽性堿性磷酸酶染色陽性;向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化14天后約50％的細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)油紅O陽性脂肪顆粒。這些結(jié)果證明所獲得的貼壁細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征，與對(duì)照組細(xì)胞相比，衰老組細(xì)胞誘導(dǎo)分化能力顯著降低。
　　 5.差異基因信號(hào)通路及基因聚類分析:將衰老組細(xì)胞與對(duì)照組差異表達(dá)的基因進(jìn)

7、行KEGGpathway分析(p＜0.05)，可見衰老組顯著上調(diào)通路有20條，其中包括自身免疫病、退行性疾病相關(guān)通路，下調(diào)通路49條，涉及通路包括合成代謝、細(xì)胞外基質(zhì)、物質(zhì)代謝和細(xì)胞增殖等。對(duì)41000+條基因進(jìn)行檢測，差異基因多達(dá)8000個(gè)，對(duì)顯著差異的2000個(gè)基因進(jìn)行聚類分析，顯示差異基因涉及轉(zhuǎn)錄、翻譯、生物合成、物質(zhì)代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞間連接等多方面。
　　 6.PCR驗(yàn)證:熒光定量PCR示衰老組細(xì)胞

8、與對(duì)照組細(xì)胞相比，BAX，F(xiàn)ADD，JAK2，IGF3BP5，PDK1和MGMT等基因在衰老細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，而Col-Ⅲ，Col-Ⅳ，SMAD2，SAMD4，BMPR2，CCND2和PAK2等基因表達(dá)下調(diào)。
　　 結(jié)論
　　 1.第3代對(duì)照組細(xì)胞及第15代衰老組細(xì)胞具有增殖潛能、相同的細(xì)胞表型，并能向成骨、脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化，但衰老組細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、增殖速度和誘導(dǎo)分化的能力均較對(duì)照組降低。
　　 2.體外培養(yǎng)人臍帶間