楊樹抗病防御相關(guān)基因克隆及功能分析.pdf

1、本研究使用楊樹基因組數(shù)據(jù)庫JGIP.trichocarpav1.0(http：//genome.jgi-psf.org/Poptrl/Poptrl.home.html)對38個差顯序列進(jìn)行了重新注釋。注釋結(jié)果顯示11個差顯序列為功能未知或和抗病防御相關(guān)；進(jìn)而使用實時定量RT-PCR進(jìn)行驗證工作，實驗結(jié)果顯示在抗病植株Ⅰ-69(Populusdeltoidescv.‘Lux’(Ⅰ-69/55))中兩個差顯序列69-Ⅲ-4和69-Ⅱ-6受病

2、原菌(Marssoninabrunneaf.sp.multigermtubi)誘導(dǎo)劇烈上調(diào)，69-Ⅲ-4為脂肪氧化酶基因，其在病原侵染后的晚期被誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)；69-Ⅱ-6為DNA損傷修復(fù)蛋白基因，其在病原誘導(dǎo)早期誘導(dǎo)上調(diào)。在本研究中，作者從RNA的提取，內(nèi)對照基因的選擇和擴(kuò)增效率3個方面對實時定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，建立了一套簡便可靠的實時定量RT-PCR的方法，并使用方差分析給與驗證。本研究在美洲黑楊Ⅰ-69中克隆得到兩個脂肪

3、氧化酶基因PdLOX1和PdLOX2(GenBankaccessionno.DQ131178，DQ131179)。原核表達(dá)分析PdLOX1和PdLOX2,外源蛋白與預(yù)測分子量吻合并具有脂肪氧化酶活性。推導(dǎo)氨基酸序列與已知的脂肪氧化酶進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)PdLOX1和PdLOX2屬于脂肪氧化酶類型Ⅱ13-LOX類群，該類群脂肪氧化酶同多種生物和生物脅迫相關(guān)。使用實時定量RT-PCR對PdLOX1和PdLOX2受楊樹真菌病原，機(jī)械損傷，茉莉

4、酸甲酯，水楊酸處理時的表達(dá)情況進(jìn)行分析表明：PdLOX1和PdLOX2均受M.f.sp.Multigermtubi誘導(dǎo)上調(diào)，PdLOX1受誘導(dǎo)能力較強(qiáng)；兩個基因均受茉莉酸甲酯和機(jī)械損傷誘導(dǎo)上調(diào)；在水楊酸處理時PdLOX1和PdLOX2表達(dá)水平下降，通過正向高效液相色譜分析表明兩個脂肪氧化酶的酶產(chǎn)物主要為13-HPOD，表現(xiàn)為13-LOX活性，可能參與了茉莉酸的體內(nèi)合成。通過以上結(jié)果我們推測這兩個脂肪氧化酶可能在楊樹抵抗生物和非生物脅迫中

5、具有重要的作用。本研究中利用楊樹基因組初步注釋結(jié)果和美洲黑楊受真菌病原Marssonina誘后的特異表達(dá)的差顯片段69-Ⅱ-6序列，克隆了一個DRT100同源基因。原核表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)其具有互補(bǔ)宿主菌recA突變的能力，而且其表達(dá)可受真菌病原和水楊酸誘導(dǎo)上調(diào)，在茉莉酸甲酯處理下其表達(dá)量下降。在本研究中，還同源克隆了一個楊樹PGIP基因，其與擬南芥中的PGIP1，2基因高度相似，以上工作為闡述DRT100基因同PGIP基因功能的異同提供了基礎(chǔ)