蘋果斑點落葉病抗病基因Mal d 1的克隆及功能分析.pdf

1、蘋果斑點落葉病作為嚴重的真菌病害，每年會對我國蘋果產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟造成重要影響。目前，國內外針對該病的研究主要集中于防治方法、病原菌鑒定、抗病品種的選育等，但對其抗病機理并不明確。近來有研究發(fā)現(xiàn)，蘋果葉片受斑點落葉病、黑星病、火疫病脅迫后，可誘導Mald1基因表達參與防御反應，但其在蘋果防御反應過程中的具體作用還需進一步挖掘。鑒于蘋果抗病基因挖掘的重要意義，本研究克隆了抗病相關Mald1基因，初步完成了其功能鑒定，解析了Mald1基因在蘋果抗病

2、過程中的表達特點，研究結果將為進一步開展蘋果抗病新種質的遺傳改良和定向選育提供理論依據(jù)和技術參考。
　　本文以‘王林’蘋果葉片為試材，克隆得到Mald1基因，通過生物信息學分析、表達特性分析、轉基因植物材料抗病性鑒定、融合蛋白的誘導表達等方法對該基因的功能進行了初步研究，獲得的主要研究結果如下:
　　1.通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)Mald1開放閱讀框長度為480 bp，編碼159個氨基酸殘基，包含2個外顯子和1個內含子，預測由1

3、9種已知氨基酸組成，分子量約為17.62kD，等電點為5.68，脂肪族指數(shù)為82.26，不穩(wěn)定指數(shù)為31.80，預測為親水性蛋白。利用PSORT Prediction工具對蘋果Mal d1蛋白進行細胞定位，推測蘋果Mal d1蛋白極有可能存在于細胞質當中。根據(jù)Mal d1蛋白的三維結構預測模型可知:可能構成α螺旋結構的推測有35個氨基酸、構成β折疊結構的推測有48個氨基酸、構成無規(guī)則卷曲的推測有76個氨基酸。
　　2.實時熒光定量

4、PCR分析結果顯示，Mal d1在蘋果葉、花、果皮、果肉中均有表達，但各器官中表達水平存在差異;在不同發(fā)育時期的果皮中都有表達，表達量隨時間的延長呈先上升后下降的趨勢;在不同品種葉片中均有表達，特別是抗性品種葉片中表達水平較高;在葉片人工接種病菌條件下表達量隨時間的延長明顯高于對照組。上述結果表明Mal d1基因參與植物與病原菌的互作。
　　3.利用PRI101-AN載體和農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方法轉化蘋果愈傷組織并進行轉基因愈傷組

5、織抗病鑒定，結果顯示轉Mald1基因的愈傷組織相較未轉基因的愈傷組織，發(fā)病晚、癥狀輕、病菌發(fā)展速度慢。
　　4.將Mald1基因與原核表達載體pColdⅡ連接，經(jīng)測序確定所構建的重組載體pCold-Mal d1開放閱讀框正確。將獲得的重組質粒pCold-Mal d1轉化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，經(jīng)冷誘導后SDS-PAGE電泳檢測，證明Mald1蛋白獲得了穩(wěn)定而高效的表達，所表達蛋白是大小約為22.4 kD的融合蛋白，后經(jīng)鎳柱