水稻抗白葉枯病基因Xa23的分子標(biāo)記定位及基因組文庫(kù)構(gòu)建.pdf

1、本文針對(duì)水稻抗白葉枯病基因Xa23基因的進(jìn)一步分子定位和克隆，開(kāi)展了系列研究，取得了主要結(jié)果如下： 1.選取第11染色體長(zhǎng)臂G257至G1465區(qū)間的15個(gè)RFLP探針進(jìn)行親本間多態(tài)性分析，共6個(gè)標(biāo)記在親本之間存在多態(tài)性，其中探針C1003A距Xa23基因最近，兩者間遺傳圖距為0.4cM。 2.由于分子標(biāo)記輔助選擇育種的需要，將標(biāo)記C1003A轉(zhuǎn)化為STS標(biāo)記STS03，為育種學(xué)家提供穩(wěn)定、方便的分子標(biāo)記。 3.

2、以CBB23黃化苗為材料，以pYLTAC68HB為載體，構(gòu)建了TAC基因組文庫(kù)。該文庫(kù)由68736個(gè)克隆構(gòu)成，插入片段平均大小為32kb，約覆蓋水稻基因組5.1倍。 4.根據(jù)國(guó)際水稻基因組測(cè)序計(jì)劃公布的水稻日本晴第11染色體長(zhǎng)臂上的測(cè)序結(jié)果，本研究以C1003A序列和RM206引物信息進(jìn)行BLAST比對(duì)，建立了跨Xa23基因等位位點(diǎn)的跨疊克隆群。以跨疊克隆群序列設(shè)計(jì)特異引物31對(duì)，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了更緊密連鎖的標(biāo)記A89a2、A

3、K601、CF20和A83b4。其中A89a2和AK601與C1003A均位于Xa23的近著絲粒一側(cè)，而CF20和A83b4位于另一側(cè)，這些標(biāo)記距Xa23基因的遺傳距離分別為0.4、0.2、0.2和0.4cM。 5.利用IR24和CBB23雜交構(gòu)建的共1076個(gè)單株的F2群體，菌系P6鑒定表明，F(xiàn)2群體的抗感反應(yīng)非常清晰。將標(biāo)記STS03和A83b4進(jìn)行全部F2植株的檢測(cè)，表明將Xa23定位于標(biāo)記STS03和A83b4之間是正確

4、的。由于JG30和IR24有著不同的遺傳背景，篩選了在JG30/CBB23之間沒(méi)有多態(tài)性的引物，又獲得了4個(gè)更緊密連鎖的標(biāo)記，分別是A8A、A8C、CF6、LJ478。將在標(biāo)記STS03和A83b4之間發(fā)生交換的F2植株種植其F3代家系，接種鑒定表明F3代群體的抗/感分離比例完全符合預(yù)期值。結(jié)合JG30/CBB23群體的定位結(jié)果，將Xa23定位于標(biāo)記AK601和CF20之間。 6.將BAC克隆6O8用Sau3AⅠ內(nèi)切酶不完全消化

5、連接到表達(dá)載體pCAMBIA130和pYLTAC747HB，構(gòu)建了兩套亞克隆文庫(kù)，分別挑取了重組子396個(gè)和200個(gè)，其插入外源片段大小分別為為6～12kb和10～25kb。 7.使用RiceGAAS軟件對(duì)陽(yáng)性BAC克隆序列進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，確定ORF4、5、6、7和8是候選基因。篩選pCAMBIA亞克隆文庫(kù)，獲得了分別包含有ORF4、5、7和8完整序列的表達(dá)載體克隆，其中ORF6編碼區(qū)較大，沒(méi)有獲得包含完整序列的克隆。經(jīng)農(nóng)桿菌遺傳