水稻抗白葉枯病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)基因研究及新型轉(zhuǎn)基因標(biāo)簽的開(kāi)發(fā).pdf

1、水稻白葉枯病是由水稻白葉枯病菌引起的細(xì)菌性病害，嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量。目前，培育抗病品種是抵抗白葉枯病菌侵染的最經(jīng)濟(jì)有效的措施。然而，白葉枯病菌容易產(chǎn)生致病性的分化，因此，培育抗病品種不是一勞永逸的，需要不斷的利用基因輪換和多基因聚合等技術(shù)，以獲得廣譜并且具有持久抗性的品種。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)體細(xì)胞不對(duì)稱雜交技術(shù)，獲得了高抗白葉枯病菌的品種Y73。通過(guò)優(yōu)化AAM懸浮培養(yǎng)基配方和調(diào)整農(nóng)桿菌侵染溫度，將Y73的轉(zhuǎn)基因效率提高至66.

2、5％，并利用農(nóng)桿菌侵染實(shí)驗(yàn)，初步探索了Y73中農(nóng)桿菌侵染相關(guān)基因的表達(dá)模式。另外，在分析芯片數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，一個(gè)NBS-LRR類基因的表達(dá)量在接種白葉枯病菌PXO341后明顯上調(diào)。利用分子克隆技術(shù)，克隆得到該基因，通過(guò)序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其序列與玉米R(shí)p1的序列具有較高的相似性，因此命名為OsRP1L1(Oryza sativa Rp1-like1)基因，RAP-DB(Rice Annotation ProjectDatabase)數(shù)據(jù)顯示該基因

3、編碼RPP13類似蛋白。本研究針對(duì)OsRP1L1展開(kāi)了一系列的工作，對(duì)該基因的功能進(jìn)行了分析，并已取得以下結(jié)果:
　　1.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得OsRP1L1超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。通過(guò)PCR鑒定和卡方分析，確認(rèn)了三個(gè)單插入位點(diǎn)的純合體超表達(dá)株系。連續(xù)的觀察和檢測(cè)顯示，該基因的超表達(dá)可在后代中穩(wěn)定遺傳。
　　2.構(gòu)建了雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(bimolecular fluorescence complementation，B

4、iFC)相關(guān)載體，并在煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中對(duì)該基因的互作進(jìn)行了初步的研究。結(jié)果顯示，該基因沒(méi)有明顯的自身互作現(xiàn)象。目前我們已經(jīng)構(gòu)建了酵母雙雜交(yeast two-hybrid system，Y2H)載體，并開(kāi)展了相關(guān)的篩選工作，以期篩選與其互作的蛋白。
　　3.激素和環(huán)境脅迫處理顯示，在JA、SA、高鹽和高溫處理石狩白毛(OryzasativaL.ssp.Japonica cv.Ishikari-shiroge，I-S)后，OsR

5、P1L1表達(dá)量下降，2，4-D處理后OsRP1L1的表達(dá)量上調(diào)，說(shuō)明該基因響應(yīng)多種激素和非生物脅迫處理。芯片數(shù)據(jù)結(jié)果分析顯示，與對(duì)照相比，OsRP1L1超表達(dá)材料中有26個(gè)基因的表達(dá)差異大于2倍，其中有25個(gè)基因的表達(dá)上調(diào)，1基因的表達(dá)下調(diào)。查閱相關(guān)資料后發(fā)現(xiàn)，有7個(gè)基因同時(shí)也受OsbZIP46的調(diào)控。這些結(jié)果表明該基因在水稻抗病抗逆境途徑中具有潛在的信號(hào)傳導(dǎo)功能。
　　4.通過(guò)抗譜分析，我們發(fā)現(xiàn)該基因的超表達(dá)材料對(duì)部分生理小種的

6、抗病性有所改變。
　　5.構(gòu)建了OsRP1L1-sGFP融合表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株。采用振動(dòng)切片技術(shù)及激光共聚焦顯微觀察，發(fā)現(xiàn)綠色熒光主要集中于細(xì)胞核中，推測(cè)OsRP1L1編碼蛋白定位于細(xì)胞核中。
　　此外，為加速相關(guān)轉(zhuǎn)基因操作中鑒定的效率，開(kāi)發(fā)了HPT-mCherry融合標(biāo)簽，研究成果如下:
　　1.利用融合PCR技術(shù)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，成功構(gòu)建了包含HPT-mCherry融合標(biāo)簽的轉(zhuǎn)