MicroRNA-126在肝纖維化過程中對IκBα基因調控作用的初步研究.pdf

1、[目的]構建穩(wěn)定的包含有MicroRNA-126(miR-126)結合位點的IκBα基因3'UTR的真核表達質粒載體，并轉染至人肝星狀細胞(LX-2細胞)，探討miR-126和IκBα在參與肝纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中的可能機制，為進一步探索肝纖維化的基因治療提供理論依據(jù)。
　　 [方法]根據(jù)MicroRNA靶基因預測軟件提供的miR-126與IκBα3'UTR的結合位點，人工合成一段PCR擴增引物，同時設計、合成一段突變序列作為對

2、照組，各自退火形成雙鏈DNA后，分別克隆到含有雙熒光素酶報告基因的質粒psiCHECK-2 Vectors，構建成含有miR-126與IκBα3'UTR結合位點的重組質粒及突變對照質粒，并對重組質粒進行雙酶切瓊脂糖電泳和測序鑒定。通過脂質體Lipofectamine2000介導，將構建好的質粒載體與miR-126共轉染人肝星狀細胞，通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，進行熒光素酶活性分析。
　　 [結果](1)PCR擴增鑒定證實目的

3、基因片段分別被成功克隆到質粒psiCHECK-2 Vectors中，同時測序結果也證明兩組重組質粒的插入序列與設計的靶基因片段完全一致。(2)雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析測定結果顯示：在轉染克隆有IκBα基因3'UTR質粒的實驗組中，miR-126組與空白組及NC陰性對照組的比較中，熒光素酶的活性明顯受到抑制(P<0.01)，當加入miR-126抑制劑后，與miR-126組比較，熒光素酶的活性抑制減弱，與其他組比較熒光素酶的活性差異無明顯性(

4、P>0.05)，證實miR-126能與IκBα基因3'UTR結合，從而抑制熒光素酶的活性；在轉染PisCHECKTM-2原質粒和克隆有mut Iκdα基因3'UTR質粒的實驗組中，miR-126組與空白組及NC陰性對照組比較，熒光素酶的活性變化差異無顯著性(P>0.05)，證實miR-126不能與mut Iκdα基因3'UTR結合，而抑制熒光素酶的活性。
　　 [結論]成功構建包含有miR-126與IκBα3'UTR的結合位點的